细胞增殖检测方法的研究进展

袁湘祥,徐昕荣,蒋捷新,吴春琼,石志峰

(华南理工大学医疗器械研究检验中心,广东 广州 510006)

细胞增殖是生物体的重要生命特征,是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础.体外细胞增殖试验通常是检测细胞群体发生的变化或检测分裂中的细胞数.在方法上主要是通过检测细胞的代谢活性物、DNA合成及增殖相关抗原,进而间接了解细胞的增殖水平[1].在医疗器械领域GB/T 16886.5-2017指定体外细胞毒性试验采用MTT法进行检测[2].药物筛选主要采用四甲基噻唑蓝法、结晶紫染色法及SRB法进行检测[3].在免疫学研究中,细胞增殖指数是反应机体细胞免疫应答水平的重要指标之一,CCK-8法、MTT法以及3H-TdR和BrdU法常用于免疫细胞的增殖活性检测.在化妆品功效评价方面,细胞毒性和细胞增殖是检测化妆品功效的基础,也是功效原料安全剂量选择的重要手段,具有代表性的检测方法主要是MTT法,该试验法是分析化合物的毒性终点试验之一[4].近几年报道的文献资料中细胞增殖的检测方法采用MTT法及CCK-8法较多,而之前的报道多采用3H-TdR法和BrdU法.3H-TdR法试验结果重复性较差,同时还存在放射性污染,常被运用于科研,而较少运用于临床,利用BrdU法虽可避免放射性污染,但该方法易受到外源性示踪物的影响[5].随着细胞增殖相关抗原物质被发现及其相应的单克隆抗体问世,该方法以其重复性高、无放射性污染、方法简便同时可运用于石蜡切片进行观察等优点被迅速运用于临床[5].

不同检测方法存在各自的优缺点,在不同的研究领域中对于细胞增殖的检测通常会采用不同的方法,以下对此展开综述.

1 代谢活性检测

1.1 四甲基偶氮唑盐法(MTT)

MTT法又称为噻唑蓝比色法,于1983年建立.MTT法是一种快速评定细胞毒性的比色分析方法,是生物材料安全性评价体系中的重要分析方法之一[6].其原理在于活细胞在代谢过程中,琥珀酸脱氢酶能将可溶性的MTT还原为可溶于二甲基亚砜(DMSO)的蓝紫色甲瓒晶体,由于甲瓒的生成量与活细胞数量呈正相关,利用酶标仪测定的吸光度值可间接反应活细胞的相对数量.该方法较为简便、安全、快捷且成本较为低廉,被广泛运用于多种类细胞的增殖检测、药物筛选及细胞因子的活性检测[7].但MTT法会因DMSO溶解甲瓒颗粒不全而导致结果重复性较差,过氧化物及重金属也会影响该方法的准确性[8-9].该方法还广泛运用于肿瘤放射敏感性测定、抗肿瘤药物的大规模筛选以及生物活性因子的活性检测等[10].在抗肿瘤药物的筛选试验中,运用该方法需考虑到药物的挥发性,若未针对挥发性确定合理的试验条件将会影响到试验结果的准确性[11].

1.2 二甲氧唑磺比色法(XTT法)

二甲氧唑磺比色法(XTT法)在1988年由Scudiero最先报道[12].XTT法是检测细胞增殖的另一种代谢活性物检测方法,XTT是与MTT相类似的四唑氮衍生物,可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性黄色甲瓒,甲瓒的生成量与活细胞数量呈正相关,该方法无需溶解还原产物结晶,可直接利用酶标仪进行检测.XTT较MTT法更为简便、快速、数据客观、无同位素污染、重复性较好,适用于悬浮细胞及贴壁细胞的检测[13].该方法主要运用于多种细胞的增殖检测、细胞毒检测及药物筛选等.由于XTT水溶液不稳定,因此需要低温保存,现配现用.XTT代谢产物呈黄色,在培养过程中细胞产生的黄色代谢物或黄色试剂会影响试验的检测结果[14].与MTT法一样,XTT法的检测结果同样易受到过氧化物的影响,从而导致试验结果的不准确性[9].XTT法对多种肿瘤细胞的检测效率比MTT法低,但当在检测中加入了偶联剂PMS时,XTT法的检测效率将大大提高,因此该方法已逐渐受到研究者们的重视[13].

1.3 内盐法(MTS)

内盐法(MTS)的试验原理与XTT法相类似,MTS是新型MTT类似物,在偶联剂PMS的作用下可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原为有色的水溶性甲瓒产物,其颜色深浅在一定范围内与活细胞数量呈正相关性.该方法优点在于操作方法简便、快速、特异性强、安全性高.MTS法相较于MTT法检测结果更加准确,主要应用于细胞毒性检测、药物敏感性试验及细胞增殖检测等[15-17].

1.4 四唑单钠盐法(WST-1)

四唑单钠盐法(WST-1)与XTT法原理相类似,WST-1是与MTT类似的水溶性四唑盐,是MTT的升级替代产品,由日本同仁化学研究所开发,经线粒体脱氢酶还原形成水溶性橙黄色甲瓒产物,甲瓒产生量与活细胞数量呈正相关,甲瓒无需后续溶解.WST-1的化学特性更加稳定,试验产物更易溶解,实验结果更加稳定、准确性高[18].WST-1对细胞无明显毒性,可在多时间点反复进行数据读取,检测时间灵活,因此便于找到数据最佳读取时间.

1.5 Cell Counting Kit-8(CCK-8)

CCK-8的主要成分为WST-8,WST-8检测原理与WST-1类似,与WST-1同是由日本同仁化学研究所开发的水溶性四唑盐,化学性质较WST-1更稳定,更易于保存.CCK-8的检测灵敏度较MTS、XTT和MTT更高,数据重复性更好,可靠性更高,且操作简便,对细胞无明显毒性.CCK-8在应用上更适用于大规模药物的筛选,细胞毒性试验、生物活性因子的活性检测和细胞增殖检测[19-21].在细胞类型上,该方法更适用于悬浮细胞.由于CCK-8的细胞毒性低,因此在检测后细胞还可重复利用,该方法相较于MTT法更具有实用性,可替代MTT法,具有更好的应用前景[22].

1.6 CFDA-SE法

羟基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)是一种可穿过细胞膜的荧光染料,常用于观察细胞的长期活动及活细胞检测,当染料进入细胞后,细胞内的酶酯可水解其乙酸盐基团使其转变为具有绿色荧光的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯,其琥珀酰亚胺基团将不可逆地与细胞内酯基结合,形成稳定的酰胺结合物.当细胞发生分裂时,CFSE标记荧光将被平均分配到两个子代细胞中,一个连续传代的细胞群,其荧光强度以1/2递减,利用流式细胞仪对细胞发出的荧光信号进行收集,即可分析细胞的增殖情况.CFDA-SE检测方法被广泛运用于淋巴细胞增殖检测,CFSE还可与其它抗体配合,利用流式细胞仪同时对不同淋巴细胞亚群的增殖水平进行检测[23].

2 DNA含量检测

2.1 胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法

胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法早期主要用于药物敏感性实验及细胞增殖检测[24].该方法首先是利用氚(3H)标记的胸腺嘧啶核苷作为DNA合成的前体摄入到DNA合成的过程中,通过检测细胞的放射强度进而间接反应细胞的增殖水平.该方法敏感度高、特异性强但该方法的检测周期较长,不能检测失能的T细胞且会导致检测值偏低,同时在试验过程中实验人员易受到放射性危害.

2.2 2,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)法

2,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)法是通过检测细胞DNA合成进而间接反映细胞增殖水平的另一种细胞增殖测定方法.BrdU的胸腺嘧啶环上与第5位C连接的甲基被溴取代,进而形成一种胸腺嘧啶核苷类似物,在DNA合成过程中可替代脱氧胸腺嘧啶核苷摄入到新合成的DNA中,加入固定液使细胞DNA变性,利用过氧化物酶标记的抗BrdU抗体与细胞DNA上的BrdU相识别,后通过酶标仪检测形成的免疫复合物.检测结果OD值与细胞DNA合成量正相关,进而能间接反应细胞的增殖水平[25].该方法与胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法相比具有较多的优势,如无需同位素放射物,OD值与细胞增殖水平强相关,检测过程简便快速.张为宇等[26]利用3H-TdR渗入法和BrdU法进行了同一批次的细胞增殖试验,并对两种试验方法的结果进行了比较,结果表明在同一试验中3H-TdR渗入法和BrdU法同样敏感.

2.3 3,5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶(EdU)法

3,5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶(EdU)法与BrdU法原理类似,EdU的脱氧胸腺嘧啶环上的第5位C原子连接的甲基被乙炔基取代形成胸腺嘧啶核苷类似物,在DNA合成期(S期),可替代脱氧胸腺嘧啶核苷摄入到新合成的DNA中,利用荧光标记的BrdU抗体与BrdU结合即可反应处于增殖期的细胞.EdU的乙炔基可与荧光染料标记的小分子探针反应形成稳定的三唑环,这一反应在生物学系统中较为少见,因此该方法在检测过程中背景干预小,敏感性高[27].EdU法相比于BrdU法检测时间更短、更加灵敏、准确,EdU染料与BrdU抗体相比更容易穿过细胞膜,在细胞内扩散,操作中无需对DNA进行变性处理,避免DNA分子结构受到损伤,保证了DNA分子结构的完整性,能更加准确地反映DNA的复制活性.该方法更加适用于DNA修复、细胞标记示踪和细胞增殖等方面的研究.该方法可选用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜和流式细胞仪等进行检测.

2.4 流式细胞术

流式细胞术是集电子技术、现代激光技术、生物学技术于一体的高通量细胞检测技术,也是检测细胞增殖最为准确的一种方法.其原理主要在于:带有荧光标记的单克隆抗体与待测细胞的表面标记物相互作用或将荧光染料与细胞核核酸结合,当待测细胞经过流式细胞仪的激光束,仪器将捕捉细胞束产生的荧光信号,仪器将自动对细胞进行分类计数.碘化丙啶(PI)是流式细胞术检测中常用的DNA染色剂,当单细胞悬液经通透处理后加入PI,当PI与DNA双链结合后,此时,PI由488 nm或561 nm的激光激发,产生610～620 nm之间的发射光谱,光谱的信号强度与DNA含量成正比,该方法常被运用于细胞周期及细胞凋亡检测[28-32].PI的优点在于其操作简便,荧光信号稳定,CV值小,抗光漂白性良好[33].但PI与常用染料藻红蛋白(PE)的检测光谱重叠较高,与绿色荧光蛋白(GFP)及异硫氰酸荧光素(FITC)等染料也存在部分光谱重叠,因此,PI在使用过程中不能同时利用PE、FITC、GFP等染料标记其它指标,同时,PI染料能与双链RNA结合,因此在检测前需对样本进行RNase处理,排除干扰[33].Hoechst 33342同样为DNA染色剂,以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对发生特异性结合,由355 nm紫外激光器激发,发射光谱为460 nm,该染料与488 nm激光器激发的染料不存在光谱重叠,因此在检测过程中受其它染料光谱的影响较小[34].随着流式细胞仪激光器配置的升级,多色检测是今后发展的必然趋势,由于PI与FITC、PE存在较大的光谱重叠,因此,有必要开发新的DNA染料替代PI.卢乃丽等采用流式细胞仪上更为普及的405 nm激光器替代355 nm的紫外激光器激发Hoechest 33342染色细胞DNA,最终DNA定量结果与PI染色法显示结果基本一致,此外,Hoechest 33342染料能特异性与DNA结合,无需对样本进行RNase处理,因此相比于PI染色而言该方法简化了试验步骤,是一种更值得推广的DNA周期检测法[35].

3 细胞增殖相关抗原检测

3.1 Ki67

Ki67抗原于增殖期细胞的细胞核中表达,由两条多肽链组成,相对分子质量分别为395 kDa和345 kDa,目前研究尚未明确其具体功能,该抗原可能是染色体支架的某种组分或是为DNA复制提供场所的核基质.Ki67抗原在除G0期、G1早期以外的其他细胞周期中表达.Ki67与肿瘤细胞的增殖密切相关,其主要运用于判定细胞的增殖活性,可用于区分正常细胞和肿瘤细胞,二者的Ki67免疫组化结果有显著不同,该方法可运用于判定良性肿瘤与恶性肿瘤,肿瘤分型、分级及预后转归等.

3.2 PCNA

PCNA是与细胞分裂周期相关的核蛋白,大小为36 kDa,是细胞DNA复制过程中的关键因子,主要作为DNA聚合酶δ的辅助因子发挥作用.PCNA具有不可溶性和可溶性两种,前者的含量变化与DNA合成过程一致,在G0期不表达,G1晚期表达量增加,S期表达量最高,G2至M期表达量下降.该方法可用于检测细胞增殖过程的动态变化,对肿瘤治疗的预后判断具有重要意义[36,37].

4 小结

在医疗器械领域,体外细胞毒性是生物学评价体系中经常进行的试验检测项目,该试验旨在离体状态下模拟细胞的生长环境,检测医疗器械产品与人体组织接触后的生物学反应[38].目前,医疗器械生物学评价主要采用MTT法,然而医疗器械领域发展迅速,产品种类繁多,MTT法是否适合所有种类的医疗器械评价还有待于进一步研究验证.刘永帅[39]指出MTT法运用于葡聚糖磁性纳米材料的评价时会过高的评价了样品的细胞毒性,出现假阳性结果.CCK-8法目前尚未收入到新版16886.5中,但CCK-8的确在结果的灵敏度及重复性方面比MTT法更加具有优势,在旧版16886.5中还增加了XTT细胞毒性试验,目前有必要针对这三种检测方法进行深入交叉对比[2].在免疫学方面,淋巴细胞增殖活性是反映机体细胞免疫应答水平的重要指标,静止状态下的淋巴细胞经有丝分裂原刺激,如刀豆球蛋白、植物血凝素,可产生多克隆T、B细胞增殖、分化.经病原体感染的宿主,其淋巴细胞经体外分离后在特异性抗原的刺激作用下也可发生细胞的增殖、分化,当宿主处于免疫抑制状态下其细胞增殖水平将减弱.在药物筛选方面,由于组织器官和动物的筛选规模小,因此以上两种模型主要运用于成药后的筛选[40].在细胞水平上进行药物筛选是最为常见的方法,在筛选上主要选取肿瘤细胞系为模型,将待筛选药物与细胞相互作用,进而采用结晶紫染色法、SRB法、四甲基噻唑蓝法检测药物的作用强弱[3].在化妆品安全性评价方面,细胞毒性试验主要用于检测化合物的远期效应及潜在毒性,MTT法因其具有与同位素掺入法同样的灵敏度,同时具备快速、简便、准确的特点而得到广泛运用,欧盟国家已将该方法列为化妆品毒理学安全程序的检测项目之一[41].

3H-TdR渗入法由于试验检测过程中会产生一定的放射性,对试验人员造成伤害,因此目前的研究中采用该方法进行检测的较少.现如今较常用的方法主要是MTT及CCK-8,CCK-8方法对细胞毒性更低,方法更简单、灵敏度、准确度和可重复性更高,因此该方法的利用价值更大.然而,针对淋巴细胞这种多细胞亚群的细胞增殖试验,在同一试验过程中不同细胞亚群的增殖水平存在差异,若需对特定亚群的增殖反应进行检测,流式细胞术是检测方法的首选,其它方法,例如3H-TdR渗入法、MTT法及CCK-8法通常存在非特异性、敏感性低、结果误差大的缺点,影响试验结果的准确性[23].

5 展望

细胞增殖检测是评估细胞功能的重要方法,不同方法各具有优缺性,因此在针对不同检测试验应当对不同方法进行灵活选择,同时应避免采用单一方法,应结合试验要求及试验目的选择特异性和灵敏性较高的多种方法,以此达到方法可靠,结果准确的要求.相比于常规的检测方法,流式细胞术最大的优势在于多色,多参数检测,能有效实现增殖和其他指标同时检测或多细胞群体中单一细胞类型的增殖检测,不同染料的染色原理不同,所使用的激光检测通道也存在差异,可根据仪器配置及试验方案进行选择.随着多色流式细胞检测技术的不断发展,从单一样本中获取更多生物信息是今后不断发展的趋势.