熟党参中5-羟甲基糠醛提取工艺优选

吕立铭，高 娟，李大炜，侯秋苑

（1.惠州卫生职业技术学院，广东 惠州 516025；2.惠州市药用植物研究与开发重点实验室，广东 惠州 516025）

党参又称上党人参，是临床常用的一味补益类中药，也是药食同源性食材。来源于桔梗科植物党参、素花党参或川党参的干燥根，其味性甘平，主入足太阴脾经、手太阴肺经，功效为补中益气，养血生津，临床用于治疗脾肺虚弱，食少便溏，咳嗽气喘，气血两亏，气短心悸，津伤口渴，内热消渴等症状[1]。党参含有多种化学成分，诸如糖类[2-4]、炔类[2，3，5]、黄酮类[2，3，6]、生物碱类[2，3，7]、萜类[2，3，8]和木质素类[2，3，9，10]等。传统习惯认为党参以味甜者为佳，究其原因主要是党参含有大量单糖、低聚糖等小分子糖，如蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖等[2，3，11]。上述小分子糖类成分，在炮制加工和储存等过程中，都不可避免地发生美拉德反应和糖的热降解反应（还原糖的分解及蔗糖的焦化）而产生5-羟甲基糠醛[12-13]。

5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，简称5-HMF），是由小分子糖在高温或弱酸等特殊环境下脱水产生的一种具有呋喃环结构的糠醛类小分子化合物，是中药常见的成分之一，也广泛存在于水果、面包、蛋糕及乳制品等食品中[12-13]。根据文献报道[13-15]，5-HMF对人体具有多种药理作用。抗氧化活性[16-17]、抗心肌缺血作用[18-19]、改善血液流变学[20-21]，同时，5-羟甲基糠醛对人体具有一定的毒副作用，当含量超过一定限度时，就会对人体产生危害，过量的5-羟甲基糠醛会损害人体横纹肌、内脏、基因和神经等，对眼睛、皮肤、上呼吸道及黏膜有刺激作用[11，13，22，23]，是一种具有潜在安全隐患的内源性污染物，常被作为注射液中的有害物质加以含量控制[24]。因此，控制中药中5-羟甲基糠醛的含量至关重要。党参经过清蒸加工成熟党参后，口感更加香甜，颜色加深，5-羟甲基糠醛含量急剧增加。然而，关于熟党参中5-羟甲基糠醛的提取工艺研究尚未见报道。本文以5-羟甲基糠醛含量为评价指标，采用高效液相色谱法，优选熟党参中5-羟甲基糠醛的提取工艺，为今后党参药材的质量控制和安全性研究奠定理论基础。

1 仪器与试药

1.1 实验仪器

安捷伦1260型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，美国），资生堂反相色谱柱Capcell pak C18色谱柱（资生堂公司，日本，型号4.6 mm×250 mm，5 μm），HH-8数显恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，中国），BPG-9204A电热式鼓风干燥箱（上海市百典仪器设备有限公司，中国），超声清洗机PS-40A（广东省深圳市科洁超声科技有限公司，中国），电子天平FA2004N（上海市菁海仪器有限公司，中国）。

1.2 药材与试剂

党参药材（采购于山西省晋城市陵川县六泉乡，药材经广东省惠州卫生职业技术学院中药教研室祁银德教授鉴定为桔梗科植物党参Codonopsis pilosμla（Franch.）Nannf.的干燥根，其性状符合《中华人民共和国药典（2020年版）》一部的规定，5-羟甲基糠醛对照品（GC≥98%，批号：20170519，上海市金穗生物科技有限公司，中国），甲醇（分析纯，广东省汕头市西陇科学股份有限公司，中国），乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，中国）。

2 方法

2.1 熟党参样品的制备

取生党参饮片，置蒸制容器内，隔水蒸至有香甜味时取出，干燥，得到熟党参样品[25]。

2.2 高效液相色谱法测定5-羟甲基糠醛的含量

2.2.1 色谱条件

色谱柱：资生堂反相色谱柱Capcell pak C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：V乙腈∶V水=5∶95；流速：1.0 ml/min；检测波长：280 nm；柱温：常温25℃。

2.2.2 5-羟甲基糠醛对照品溶液的制备

准确称取对照品2.8 mg，精密吸取100 mL甲醇，溶解，摇匀，备用。

2.2.3 5-羟甲基糠醛标准曲线的绘制

按“2.2.1”项色谱条件，分别精密吸取对照品溶液0.5、1、2、4、8、10 μL注入AgiLent 1260高效液相色谱仪进样检测。以5-羟甲基糠醛的进样量（x，mg）为横坐标，峰面积的积分值（y）为纵坐标进行回归，计算回归方程并绘制标准曲线。

2.3 单因素试验法

2.3.1 提取方法的优选

参考文献[26-28]，5-羟甲基糠醛的提取方法主要有超声波提取法、加热回流提取法和浸渍法。以5-羟甲基糠醛的含量为指标，对超声波提取法、加热回流提取法和冷浸法进行考察，优选提取方法。

超声波提取法：准确称取熟党参粉末（过二号筛）0.50 g，精密吸取甲醇50.0 mL，准确称定重量，常温25℃浸泡0.5 h后，超声0.5 h；待冷却后，再次称定重量，用甲醇补足减失溶剂的重量，滤过。滤渣精密加入甲醇50.0 mL，准确称定重量，常温25℃浸泡0.5 h后，超声0.5 h，待冷却后，再次称定重量，用甲醇补足减失溶剂的重量，滤过，合并2次滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取中间续滤液备用。

加热回流提取法：准确称取熟党参粉末（过二号筛）0.50 g，精密吸取甲醇50.0 mL，准确称定重量，70℃条件下加热回流0.5 h后，待冷却，再次称定重量；用甲醇补足减失溶剂的重量，滤过，滤渣再精密加入甲醇50.0 mL，准确称定重量，70℃条件下加热回流0.5 h后，待冷却，再次称定重量；用甲醇补足减失溶剂的重量，滤过，合并2次滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取中间续滤液备用。

浸渍法：准确称取熟党参粉末（过二号筛）0.50 g，精密吸取甲醇100.0 mL，密塞，准确称定重量，常温25℃浸泡24 h后，再次称定重量，用甲醇补足减失溶剂的重量，滤过，滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取中间续滤液备用。

不同提取方法5-羟甲基糠醛含量的比较。取上述3种供试品提取液，按“2.1.1”项色谱条件，精密吸取10 μL注入AgiLent 1 260高效液相色谱仪测定，计算各样品中5-羟甲基糠醛含量。

2.3.2 提取溶剂的优选

准确称取熟党参粉末（过二号筛）0.50 g，分别以甲醇、无水乙醇、水为提取溶剂，按照液固比100∶1（mL∶g），常温25℃超声波提取2次，每次提取时间为0.5 h进行试验。准确称定提取前后重量，用提取溶剂补足减失的重量，滤过，合并2次滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过。取上述3种提取液的中间续滤液，按“2.1.1”项色谱条件，精密吸取10 μL注入AgiLent 1260高效液相色谱仪测定，计算不同提取溶剂中5-羟甲基糠醛含量。

2.4 多因素正交试验

参考文献[8-10]，选择对5-羟甲基糠醛提取影响较大的3个因素，即液固比（A）、提取次数（B）及提取时间（C）作为考察对象，每个因素选择3个水平，以5-羟甲基糠醛的含量为指标，按3因素3水平设计L9（34）正交试验，各因素水平见表1。

表1 L9（34）因素水平表

3 结果

3.1 高效液相色谱法测定5-羟甲基糠醛的含量

5-羟甲基糠醛对照品的高效液相色谱图如图1所示。经计算得知，5-羟甲基糠醛的进样量（x，mg）和峰面积积分值（y）呈线性关系。其回归方程为y=5 323.8x-6.648 6，R2=0.999 9，其中x为5-羟甲基糠醛进样量，y为峰面积积分值，R为相关因子。结果表明5-羟甲基糠醛进样量在0.014～0.28 μg，其进样量（x，mg）和峰面积积分值（y）呈良好线性关系。

图1 5-羟甲基糠醛对照品高效液相色谱图

3.2 单因素试验

3.2.1 提取方法的确定

对比5-羟甲基糠醛标准曲线，根据回归方程计算各样品中5-羟甲基糠醛的含量。结果表明采用超声波提取法，测得5-羟甲基糠醛含量最高，提取效果最好，且该方法简单方便，安全性高，因此选择超声波提取法作为5-羟甲基糠醛的提取方法。不同提取方法5-羟甲基糠醛含量见表2。

表2 不同提取方法5-羟甲基糠醛含量（n=3）

3.2.2 提取溶剂的确定

对比5-羟甲基糠醛标准曲线，根据回归方程计算各样品中5-羟甲基糠醛的含量。结果表明，采用甲醇作为提取溶剂，测得5-羟甲基糠醛含量最高，提取效果最好，因此选择甲醇作为5-羟甲基糠醛的提取溶剂。不同提取溶剂5-羟甲基糠醛含量见表3。

表3 不同提取溶剂5-羟甲基糠醛含量（n=3）

3.3 多因素正交试验

由表4可见，因素A（液固比）对5-羟甲基糠醛提取效果影响最大，以后依次为因素B（提取次数）、因素C（提取时间）。提取条件的最优组合为A2B1C2。但是考虑5-羟甲基糠醛自身性质，兼顾试验效率，选择提取工艺条件为A2B1C1，即液固比100∶1（mL∶g），提取1次，每次提取0.5 h。

表4 正交试验结果与分析

3.4 验证实验

取同一批次熟党参样品3份，根据上述所选工艺，即采用超声波提取法，以甲醇为提取溶剂，液固比100∶1（mL∶g），提取2次，每次0.5 h进行提取，提取液按“2.2.1”色谱条件，分别精密吸取10 μL注入Ag－iLent 1260高效液相色谱仪测定，测得5-羟甲基糠醛含量分别为4.92、4.98、4.86，平均值为4.92，证实提取效果好，并且具有良好的重复性和较高的准确率，表明所筛选的提取工艺条件基本稳定，可作为熟党参中5-羟甲基糠醛的提取方法。熟党参样品中5-羟甲基糠醛高效液相色谱图如图2所示。

图2 熟党参样品中5-羟甲基糠醛高效液相色谱图

4 讨论

由于5-羟甲基糠醛自身的光、热等稳定性差，需低温避光保存，同时，5-羟甲基糠醛在与空气接触的过程中，醛基不稳定，易被氧化，且其吸湿性极强，暴露在空气中1 min内即会吸水变成溶液。而5-羟甲基糠醛的水溶液稳定性也很差，会进一步反应生成乙酰丙酸和甲酸，故5-羟甲基糠醛提取温度不宜过高，时间不宜过长，提取次数不宜过多。

本实验通过单因素试验和多因素正交试验优选熟党参中5-羟甲基糠醛的提取工艺，确定最佳提取工艺。即采用超声提取法，以甲醇为提取溶剂，液固比100∶1（mL∶g），提取1次，每次0.5 h，优选得到的5-羟甲基糠醛提取工艺简便易行，稳定性好，结果准确可靠，为后期熟党参中5-羟甲基糠醛的进一步研究奠定基础。