粘毛黄芩质量标准提高研究

孙倩男 张建平 渠晓艳 塔 娜 高 寒 郭宝凤

内蒙古自治区药品检验研究院中蒙药标准研究实验室，内蒙古呼和浩特 010020

粘毛黄芩系唇形科黄芩属植物粘毛黄芩的干燥根，别名腺毛黄芩、黄花黄芩，具有清热降火、泻肝利胆、明目的功效[1]，主产于山西北部、内蒙古、河北北部及山东（烟台）尤以在内蒙古境内分布广泛，野生资源储量大[2-3]。粘毛黄芩因其资源丰富、质量较好而成为最具有利用价值的地方品种之一，一些地区还将其作为黄芩的代用品使用[4]。此外，粘毛黄芩作为一种特色蒙药材，在《蒙药正典》《晶珠本草》《金光注释集》等蒙药相关书籍中均有记载，蒙古名为希日-巴布、希拉浑钦、希拉巴布、希拉巴特尔等[5]。蒙医临床所用黄芩的正品即包括粘毛黄芩[6]。粘毛黄芩中主要含有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、粘毛黄芩素Ⅰ、粘毛黄芩素Ⅱ等常见黄酮类成分[5]。近年研究还发现粘毛黄芩中含有酚酸类成分包括阿魏酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸等；香豆素类成分包括6-甲氧基-7-羟基香豆素、6，7-二羟基香豆素[7]，具有抗菌、抗炎、抗感染[8]、抗癌[9]、神经保护[10]等生物活性。

目前关于粘毛黄芩药材的质量控制情况：《内蒙古蒙药材标准》[11]《内蒙古中药材标准》[1]和《吉林省中药材地方标准》[12]收载的该药材的质量标准中仅有性状和理化鉴别项，检测指标少且专属性差。为了提高粘毛黄芩质量控制的水平，本研究参考其他品种质量标准提高的研究内容[13-15]及《中华人民共和国药典》[16]2020 年版一部黄芩项下的标准规定，拟通过增加显微鉴别和薄层鉴别项，水分、总灰分及酸不溶性灰分检查项，浸出物测定及高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定粘毛黄芩药材中的主要功效成分-黄芩苷和汉黄芩苷的含量，来完善粘毛黄芩药材的质量控制标准，达到科学、高效、经济地控制药材质量、保证用药安全有效的目的。

1 仪器与试药

1.1 仪器

9240A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；MFL-2000 型马弗炉（天津市华北实验仪器有限公司）；MSE-6.6S-000-DM 型百万分之一电子天平、MSA-224S-ICE-DU 型万分之一天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；LEICA DM3000 型智能型显微镜[徕卡显微镜（中国）有限公司]；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SF-TDL-5A 型低速大容量离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）；Ultimate 3000 型高效液相色谱仪（戴安中国有限公司）。

1.2 试药与试剂

黄芩苷对照品购于中国食品药品检定研究院（批号：110715-201821）；汉黄芩苷对照品购于中国食品药品检定研究院（批号：112002-201702）；汉黄芩素对照品购于中国食品药品检定研究院（批号：111514-201706）；黄芩素对照品：中国食品药品检定研究院（批号：111595-201607）。薄层板：聚酰胺薄膜（烟台化学工业研究所）。甲醇、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为离子交换高纯水。本研究共收集6 批粘毛黄芩药材样品，经内蒙古药品检验研究院副主任中药师郭宝凤鉴定为粘毛黄芩正品。见表1。

表1 药材来源

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

取6 批粘毛黄芩药材样品，分别粉碎过筛后，照显微鉴别法（《中华人民共和国药典》[16]2020 年版4部通则2001）制片并观察粉末的显微特征。本品粉末黄色。木栓细胞多见，棕黄色，表面观多角形，断面观呈栅状；石细胞黄色或无色，单个散在或成群，长方形、方形、类圆形、纤维状，长50～160 μm，直径14～70 μm，壁较厚，壁孔及孔沟明显，层纹较密；网纹导管多见，直径约70 μm，另有具缘纹孔导管及梯纹导管；木薄壁细胞梭形，具膈。见图1。

图1 粘毛黄芩药材粉末的显微特征（400×）

2.2 薄层色谱鉴别

2.2.1 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对照品，加甲醇制成每毫升含1、1、0.5、0.5 mg 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末1 g，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1）的混合溶液30 ml，加热回流30 min，放冷，滤过，将滤液蒸干，残渣加5 ml 甲醇使其溶解，取上清液作为供试品溶液。

2.2.3 薄层色谱条件及结果 照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》[16]2020 年版4 部 通则0502）试验，吸取上述两种溶液各1 μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）为展开剂，聚酰胺薄膜预先置展开缸中饱和30 min，展开，取出，晾干后置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示4 个相同的暗色斑点。见图2。

图2 粘毛黄芩药材中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的薄层色谱

2.3 水分、总灰分、酸不溶性灰分的测定

取各批次粘毛黄芩药材粉末约2 g，精密称定，稀乙醇为提取溶剂。粘毛黄芩药材的水分参照《中华人民共和国药典》[16]2020 年版4 部通则0832 第二法测定，总灰分和酸不溶性灰分参照通则2302 测定。浸出物参照通则2201 测定。测定结果及各项目平均值见表2。

表2 粘毛黄芩中水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物测定结果（%）

2.4 粘毛黄芩药材中黄芩苷、汉黄芩苷的HPLC 含量测定

2.4.1 色谱条件SHMADZUC18色谱柱（250mm×4.6mm，5 μm）；柱温：30℃；流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl；检测波长：278 nm；流动相为甲醇-乙腈-1%甲酸水溶液，梯度洗脱。见表3。

表3 梯度洗脱

2.4.2 混合对照品溶液的制备 分别取黄芩苷、汉黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇使溶解并制成质量浓度为42.059 6、19.384 8 μg/ml 的混合对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取1 号样品中粉约0.25 g，精密称定后置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100 ml，密塞后称定重量，然后超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，取出放冷，再次称定重量并用70%乙醇补足减失的重量，摇匀滤过后精密量取续滤液5 ml，置于25 ml 量瓶中并加70%乙醇稀释至刻度，摇匀滤过后取续滤液，即得。

2.4.4 系统适用性试验 取“2.4.2”项下混合对照品溶液和“2.4.3”项下供试品溶液按“2.4.1”项下的色谱条件进样分析，记录色谱图（图3）。结果显示在此色谱条件下，黄芩苷、汉黄芩苷与其他色谱峰分离度均＞1.5，理论塔板数均在4 000 以上。

图3 混合对照品、供试品的高效液相色谱图

2.4.5 线性关系考察 取黄芩苷和汉黄芩苷对照品精密称定，加甲醇使溶解并稀释，制成黄芩苷质量浓度分别为8.411 9、21.029 8、42.059 6、63.089 4、84.119 2 μg/ml，汉黄芩苷质量浓度分别为3.876 9、9.692 4、19.384 8、29.077 2、38.769 6 μg/ml 的混合对照品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件分析，分别测定黄芩苷和汉黄芩苷的峰面积，对照品的峰面积值为纵坐标，对照品的进样量（ng）为横坐标，进行线性回归，得到黄芩苷的回归方程为Y=0.058 9X-0.192 3，r=0.999 9，黄芩苷的进样量在84.119 2～841.192 8 ng 范围内与峰面积呈良好的线性关系；汉黄芩苷的回归方程为Y=0.066 6X+0.060 1，r=1.000 0，汉黄芩苷的进样量在38.769 6～387.696 0 ng范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.6 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样6 次，分别记录黄芩苷、汉黄芩苷的峰面积。结果显示其峰面积的RSD 分别为0.96%、1.79%，表明仪器精密度良好。

2.4.7 稳定性考察 精密吸取同一份供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h 进样分析，记录黄芩苷、汉黄芩苷的峰面积。结果显示其峰面积的RSD 分别为0.31%、1.20%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.4.8 重复性考察 取1 号样品6 份，精密称定，按“2.4.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，记录黄芩苷、汉黄芩苷的峰面积并计算其含量。结果显示其含量的RSD 分别为0.8%和1.2%。表明该方法重复性良好。

2.4.9 加样回收率试验 取已知含量的1 号样品（黄芩苷含量79.16 mg/g、汉黄芩苷含量22.81 mg/g）6 份，每份约0.12 g，精密称定，分别置于锥形瓶中，分别精密加入混合对照品溶液（分别取黄芩苷、汉黄芩苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇使溶解并制成质量浓度为0.207 85、0.057 49 mg/ml 的混合对照品溶液）50 ml，再分别精密加入70%乙醇50 ml，余按“2.4.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，记录黄芩苷、汉黄芩苷的峰面积并分别计算两成分含量。见表4。

表4 黄芩苷、汉黄芩苷加样回收率

2.4.10 样品含量测定 精密称取6 批粘毛黄芩药材粉末，按“2.4.3”项下方法制成供试品溶液，每批样品制备平行样2 份，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，记录黄芩苷、汉黄芩苷的峰面积，分别计算两成分的含量。见表5。

表5 6 批样品中黄芩苷、汉黄芩苷的含量（按干燥品计）

3 讨论

本研究的显微鉴别发现，粘毛黄芩中石细胞的镜检率较高，多呈单个散在或成群，且在粘毛黄芩粉末中未发现梭形韧皮纤维，而黄芩粉末中石细胞较少，但梭形韧皮纤维检率较高。上述两点可以作为黄芩与粘毛黄芩的生药学鉴别点。

本研究的薄层鉴别方法同时考察黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素4 个指标，可对粘毛黄芩进行快速定性鉴别，检测更加高效便捷。

本研究采用HPLC，同时测定了粘毛黄芩药材中黄芩苷、汉黄芩苷的含量，较张金花等[17]只测定粘毛黄芩中黄芩苷含量的方法，能更好地反映及控制粘毛黄芩的质量。耐用性试验方面，取重复性试验使用的样品，采用AgilentZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Alltima HP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），测定粘毛黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷的含量，结果一致，RSD 分别为0.77%、1.48%。

近年来随着中药现代化高速发展，对黄芩中黄酮类化合物的研究不断深入，如研究发现汉黄芩苷具有调节促炎因子水平、促进黏膜修复的功效[18]；黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素在黄芩治疗肠道疾病的过程中主要发挥抑制炎症、抑制氧化应激及免疫调节的作用[19]。研究还发现黄芩中的黄酮类化合物还具有抗肿瘤、心血管保护及神经保护和抗高血糖的功效[10,20-24]。以黄芩为主的药品、保健品不断涌向市场，也因此黄芩在市场的需求量居高不下。粘毛黄芩与黄芩含有部分相同的活性成分，可考虑作为黄芩的替代品或者活性成分的提取原料，既可缓解黄芩的资源短缺，也可扩大粘毛黄芩的药用范围。本研究建立的方法指标选择适宜，重现性良好，可用于粘毛黄芩的质量控制，为日后粘毛黄芩的开发利用提供理论依据和数据支撑。