氧化应激和能量代谢与中国男性精子质量的关联性研究

赵晓龙，牛治平，谭继东，韩东晖，杨发，温伟红，王安辉，秦卫军*

精子质量下降已经成为影响全球成年男性生殖健康的严重问题[1-5]。根据最近的一项Meta分析，在过去的40年，全球成年男性平均精子数量和精子密度分别下降了60%和52%，而且这一下降趋势仍在继续[2]。除了精子数量和密度快速下降外，精子活力的迅速下降使得男性生殖健康问题更加严重[6]。一项队列研究收集了489例美国城市成年男性的9 425份精液样本，结果发现2003—2013年精子总数和总活力均显著下降[6]。鉴于男性生殖健康问题日益严重，探讨其危险因素及其生物学机制具有重要意义[1]。

虽然精子质量下降的具体生物学机制尚未被阐明[7]，但氧化应激和能量代谢可能是其主要机制[8-10]。有研究表明，氧化应激升高和能量代谢降低与精子质量下降显著相关[11-13]。一项病例对照研究招募了79例畸形精子症患者和56例健康者，发现畸形精子症患者精浆的氧化应激水平显著高于健康男性[12]。30%～80%的男性不育是氧化应激导致的精子损伤[14]。同时，能量代谢在精子生成和精子运动中起着关键作用[15]。一项应用维生素D干预的研究表明，较高水平的三磷酸腺苷（ATP）与前向运动精子率的增加显著相关[16]，可能通过改善精子线粒体氧化呼吸链的功能状态来发挥作用。同时，精子运动速度和运动轨迹是评估男性生殖健康的客观依据，一项在不育男性人群的横断面研究中发现精浆中白细胞异常组与正常组之间精子的运动速度和运动轨迹存在显著差异[17]。然而，这些研究主要多基于动物实验研究，缺少来自人群的流行病学证据，而且氧化应激和能量代谢主要影响精子运动速度或运动轨迹的哪些具体参数仍不清楚。因此，本研究开展了一项横断面调查，系统评估氧化应激和能量代谢水平对男性精子质量各个参数的影响，从而识别氧化应激和能量代谢水平主要引起精子哪些参数的改变。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2021年6—12月在空军军医大学西京医院生殖医学中心进行精液质量检查的就医者中招募109例志愿者作为研究对象。研究对象纳入标准：（1）进行孕前检查精液质量的初诊男性；（2）年龄18～50岁；（3）自愿参加本次调查研究。排除标准：隐睾、患有精索静脉曲张、未治愈的生殖系统感染或既往诊断为无精症的患者。本研究由空军军医大学西京医院医学伦理委员会批准（KY20223104-TEMP），并在研究前取得所有志愿者的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料 研究对象完成简易的一般资料调查问卷，包括出生年月、学历、身高、体质量、吸烟和饮酒状况。其中吸烟定义为每天吸烟1支及以上，连续或累计6个月，饮酒定义为平均每周饮酒1次及以上[18]。

1.2.2 精液样本采集 研究对象在禁欲3～7 d后，通过手淫的方法将采集的精液样本置于无菌广口精液收集瓶内，精液样本保存在37 ℃的恒温箱中，并在精液样本完全液化后立即进行精子质量分析和氧化应激、能量代谢标志物的检测。

1.2.3 精子质量分析 精子质量分析按照《世界卫生组织人类精液检验与处理实验室手册》[19]进行。采集的精液样本由专业的检验师首先观察精液样本的精液量、颜色、黏度和液化情况，并将其登记在电子系统中。待精液完全液化后，将每个志愿者的精液样本取3 μl置于一次性精子检测板（赛斯医疗技术北京有限公司），使用计算机辅助精子分析系统（CASA）（赛斯医疗，SAS）和SASII®2.3版本软件评估精子密度参数（精子密度、直线运动精子密度）、精子活动力参数〔精子总活力、前向运动率（PR）、非前向运动率（NP）〕、精子运动速度参数〔曲线速度（VCL）、直线速度（VSL）、平均路径速度（VAP）〕和精子运动轨迹参数〔平均侧摆幅值（ALH）、平均鞭打频率（BCF）、平均移动角度（MAD）、运动的直线性（LIN）、运动的摆动性（WOB）、运动的前向性（STR）〕，CASA检测精子多项运动参数示意图见图1。

图1 CASA检测精子多项运动参数示意图Figure 1 Schematic diagram of the computer-assisted sperm analysis system for detecting multiple sperm movement parameters

为确保精子质量检测结果的可靠性，本研究精子质量检测工作均采用同一精子质量分析仪完成。该精子质量分析仪已通过西北生殖医学专科联盟精子分析室间质量控制评估，为合格在控状态。本研究所有精子质量检测由同一检验技师完成，以避免人员误差。此外，本研究所采用的精子质量分析仪的质量控制，每月使用标准浓度玻璃粉校准浓度，利用录制的精液样本标准视频录像校准精子活动力，并将CASA系统的结果与人工方法进行比较进行误差分析。研究期间该研究所采用的精子质量分析仪均符合误差要求。

1.2.4 氧化应激和能量代谢评估 氧化应激评估：将精液质量分析剩余的精液样本在室温下800×g离心15 min后，取精液上清液2 ml于EP管，后10 000×g离心30 min，取上清液，使用丙二醛（MDA）试剂盒（#BC0025，Solarbio，北京）和还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒（#BC1175，Solarbio，北京）对精液样本的氧化应激水平进行检测。较高水平的MDA代表较高的氧化应激水平；GSH水平越高，表明抗氧化水平越高，氧化应激水平越低。

能量代谢评估：将精液质量分析剩余的精液样本在室温下800×g离心15 min，弃上清液，沉淀用2 ml磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，缓慢加入盛有2 ml 50%Percoll溶液的15 ml离心管中，在室温下1 000×g离心20 min。去掉上清液后，加入2 ml PBS洗涤1次，获得最终沉淀物，立即使用增强型ATP分析试剂盒（#S0027，Beyotime，上海）对精液样本的能量代谢水平进行检测。ATP水平越高，表明精液样本用于精子运动和结合的能量供应越好。

因单次可采集的精液量有限，并且精液样本放置时间过长或冻融均会影响精液样本氧化应激和能量代谢水平的准确性，本研究将采集的精液样本分为两部分，检测精液样本中氧化应激标志物（MDA和GSH）表达水平作为氧化应激组（n=67），检测精液样本中能量代谢标志物（ATP）表达水平作为能量代谢组（n=42）。

1.3 统计学方法 采用R 4.1.2统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，非正态分布的计量资料以M（QR）表示；计数资料以相对数表示。绘制一般线性模型（GLM）分析MDA、GSH和ATP与精子质量各项参数的相关性。效应值表示为MDA每增加1 nmol/ml、GSH每增加10 mg/L、ATP水平每增加1 nmol/mg蛋白，男性精子质量各项参数的改变及95%置信区间（95%CI）。为了调整潜在的混杂因素并检验结果的稳定性，本研究统计模型包括粗模型和调整模型。首先在没有纳入任何协变量的情况下进行GLM模型拟合（粗模型）。参考以往男性精子质量的研究[20-21]，将研究采集的精液量、研究对象的年龄、体质指数（BMI）、受教育程度、吸烟和饮酒状况作为协变量纳入模型（调整模型）。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象基本特征及氧化应激、能量代谢和精子质量参数结果 本研究共纳入109例成年男性。氧化应激组MDA为2.78（1.69） nmol/ml，GSH为113.54（74.21）mg/L。能量代谢组ATP为6.61（2.26） nmol/mg蛋白。见表1。

表1 研究对象基本特征、氧化应激、能量代谢和精子质量参数结果Table 1 Statistical description of basic demographics，oxidative stress，energy metabolism and sperm quality parameters in subjects

2.2 氧化应激与精子质量各参数的关系 MDA水平与精子质量各参数的相关性上，粗模型结果显示，在精子活动力方面，MDA水平与PR、NP、精子总活力呈负相关（P<0.05）；在精子运动速度方面，MDA水平与VCL、VSL、VAP呈负相关（P<0.05）；精子运动轨迹方面，MDA水平与精子ALH、BCF、MAD、LIN、WOB、STR呈负相关（P<0.05）。在调整了研究对象的年龄、学历、BMI、吸烟、饮酒和精液量差异后，精子密度方面，MDA水平与直线运动精子密度呈负相关（P<0.05），其余结果均与粗模型结果一致。MDA水平与精子质量各参数的关系详见表2。

GSH水平与精子质量各项参数相关性上，粗模型结果显示，在精子密度方面，GSH水平与精子密度和直线运动精子密度呈正相关（P<0.05）；在精子活动力方面，GSH水平与PR、精子总活力呈正相关（P<0.05）；在精子运动速度方面，GSH水平与精子VSL、VAP呈正相关（P<0.05）；精子运动轨迹方面，GSH水平与精子ALH、BCF、MAD、LIN、WOB、STR呈正相关（P<0.05）。在调整了研究对象的年龄、学历、BMI、吸烟、饮酒和精液量差异后，在精子密度参数方面，GSH水平与精子密度无相关性（P>0.05），其余结果均与粗模型一致。GSH水平与精子质量各项参数的关系详见表3。

表3 精浆中GSH水平与精子密度、活动力、运动速度和运动轨迹的关系Table 3 Correlation of reduced glutathione in seminal plasma with sperm concentration，motility，movement velocity and trajectory

2.3 能量代谢与精子质量各参数的关系 能量代谢与精液质量各参数相关性上，粗模型结果显示，在精子密度方面，ATP水平与直线运动精子密度呈正相关（P<0.05）；在精子活动力方面，ATP水平与PR、NP、精子总活力呈正相关（P<0.05）；在精子运动速度方面，ATP水平与精子VCL、VSL、VAP呈正相关（P<0.05）；精子运动轨迹方面，ATP水平与ALH、BCF、MAD、LIN、WOB、STR均呈正相关（P<0.05）。在调整了研究对象的年龄、学历、BMI、吸烟、饮酒和精液量差异后调整模型结果均与粗模型一致。ATP水平与精子质量各项参数的关系详见表4。

表4 精子ATP水平与精子密度、活动力、运动速度和运动轨迹的关系Table 4 Correlation of ATP level in sperm with sperm concentration，motility，movement velocity and trajectory

3 讨论

本研究探讨了氧化应激和能量代谢对男性精子质量多项参数的影响。精液中MDA、GSH和ATP水平与精子活动力、运动速度和轨迹多项参数存在显著相关性。以往研究主要探究了氧化应激和能量代谢对男性精子密度和活动力的影响，本研究系统地分析了精液氧化应激和能量代谢水平与男性精子密度、活动力、运动速度和运动轨迹10多项参数之间的相关性，提示可以通过应用降低氧化应激和提高能量代谢的补充剂改善男性精子质量，为促进男性生殖健康提供流行病学证据。

本研究表明，精液中的MDA和GSH水平与精子活动力、运动速度以及轨迹改变存在相关性。根据相关研究可知，MDA和GSH是氧化应激主要且研究最多的产物[22-23]。MDA是多不饱和脂肪酸过氧化常见的产物之一，已被广泛用于评估氧化应激的水平[22]，并被认为是精浆脂质过氧化的直接指标[24]，较高水平的MDA代表严重的氧化应激水平。本研究结果表明，较高的MDA水平与较低的精子活动力、较低的精子运动速度和不良的轨迹改变相关，证明了过高的氧化应激水平对男性生殖健康的不利影响。一些研究报道了MDA与精子质量呈负相关[24-26]。例如，一项居住在波兰的346例男性的横断面研究发现，患有弱精子症的男性的MDA水平较对照组高12%[25]。GSH是保护脂质、蛋白质和核酸免受氧化损伤的非酶抗氧化防御系统的一部分[23]。GSH水平越高，表明抗氧化水平越高，氧化应激状态越低，在一些研究中GSH也被用作生殖健康的重要生物标志物[27-28]。ATIG等[28]对250例成年男性开展的前瞻性研究发现健康男性的GSH水平显著高于不育患者组；此外，该研究还指出GSH与精子总活力及精子密度显著相关；较高的GSH水平与较好的精子质量和较低的生育风险相关，本研究结果与该研究一致。综上所述，氧化应激对精子质量和男性生殖健康起着至关重要的作用。尽管氧化应激对精子质量的具体生物学机制尚不清楚，但不能忽视其对精子染色质破坏、精子膜过氧化和精子细胞凋亡增加的影响[29-30]。

ATP是精子功能的主要供能物质[31-33]。ATP水平越高越有利于精子产生足够的能量来克服女性生殖通道中的物理障碍，到达卵母细胞，并穿透其透明带[16]。本研究结果表明，较高的ATP水平与较高的精子活动力、较高的运动速度和轨迹正向变化相关，这表明能量代谢对男性精子质量有显著影响。SHAN等[34]收集60例正常精子者和50例弱精子症男性，发现弱精子症患者组ATP水平显著低于正常组〔（234.74±81.21）μmol/mg与（ 437.38±142.54）μmol/mg〕。JUERAITETIBAIKE等[16]开展了一项探讨维生素D对精子活动力影响的研究，发现ATP水平的升高与精子的PR显著相关。虽然ATP对精子质量产生影响的具体生物学机制尚不清楚，但已有试验表明，呼吸链复合体活性的下降[35]、线粒体膜电位的降低[36-38]、线粒体DNA的改变[39]以及活性氧[40-41]对线粒体的损伤是关键机制。

本研究首次系统地评估了氧化应激和能量代谢水平对精子密度、活动力、运动速度和运动轨迹等多项参数的影响，研究将为全面了解氧化应激和能量代谢对男性生殖健康的影响提供参考。然而，本研究也存在一定局限性：首先，研究对象为医院生殖医学中心就诊的育龄男性，尽管选取孕前检查的初诊志愿者，但也不能完全排除伴有生殖健康问题的志愿者，这与健康人群之间存在一定偏差。其次，因为参加精子质量检查的门诊志愿者不愿透露更多私人信息，本研究未能收集到研究对象的职业、生育情况和详细生活习惯等信息，这导致研究中可能存在一些混杂因素。但本研究将研究者的年龄、学历、BMI、吸烟、饮酒和精液量参数作为协变量纳入调整模型，且调整模型的大多数结果与粗模型一致，表明本研究的结果是稳定的。再次，本研究只纳入了67份精液样本用于氧化应激检测，42份精液样本用于能量代谢检测，未来需要开展基于更大样本量的研究来证实本研究的结果。最后，本研究采用了横断面研究设计，无法进行因果关系推断，未来需要开展队列研究来验证本研究的发现。

综上所述，较高的氧化应激水平与精子活动力降低、精子运动速度减慢以及运动轨迹发生不利改变有关，而较高的ATP水平与男性精子活动力升高、运动速度加快以及运动轨迹发生有利改变有关。针对日益严重的男性生殖健康问题，本研究提示通过应用降低氧化应激和提高能量代谢的补充剂可改善男性精子质量，为男性生殖健康的精准干预、保障我国人口稳定提供科学依据。

作者贡献：赵晓龙、牛治平负责病例资料收集和整理，并撰写论文初稿；谭继东负责试验结果整理；韩东晖提出研究选题方向；杨发、温伟红负责论文的修订；王安辉、秦卫军负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责。

本文无利益冲突。