关于豆豉微生物多样性和挥发性成分检测技术及其关联分析的研究进展

张彦赠,汤晓娟,林祥娜,纪艳青,隋智海,贺红军,刘云国*

(1.烟台大学 生命科学学院，山东 烟台 264005；2.临沂大学 生命科学学院，山东 临沂 276000)

豆豉作为一种中国传统发酵食品,有着悠久的历史。因其具有浓郁、顺滑、醇香、咸鲜的味道,成为一种独特的开胃菜,现已在世界各地广为流传[1-2]。近几年,研究证明,食用豆豉不仅有助于缓解消化不良,而且可以预防前列腺癌和乳腺癌[3]，也证明豆豉提取物具有降血糖以及抗糖尿病的作用[4-5]。因此,豆豉所具有的促进人体健康的特性也引起了广大学者的关注。

豆豉的制作一般分为前、后两个时期。前期即制曲阶段,该阶段微生物对大豆中营养物质如蛋白质、脂肪等进行初步降解,同时产生大量的酶,为后期的发酵过程进一步降解提供条件[6]。后期为后发酵阶段,该过程中微生物会将大豆进一步降解成小分子物质,如多肽、氨基酸、短链脂肪酸以及各种单糖等,是产生风味物质、功能活性物质以及营养价值的关键过程[7]。

据研究,在豆豉的后发酵过程中,微生物多样性的变化是形成豆豉最终特有风味的核心驱动力[8],对风味的形成发挥关键作用。然而只有少数研究对发酵食品及其产生的风味化合物进行相关性分析,探究发酵食品中的功能核心微生物群。因此，在研究豆豉微生物多样性和挥发性成分的变化的基础上,利用相关性分析,进一步探究微生物种群与挥发性化合物之间的关系,将有助于了解风味形成机制,为进一步探索优良发酵剂提供理论基础。因此，本文对豆豉的挥发性成分和微生物多样性变化以及两者的相关关系研究进行综述,旨在为以后提高豆豉品质、纯种发酵以及工业化生产提供一定的理论指导。

1 微生物多样性及其检测技术

1.1 传统培养方法

传统培养方法是指对基质中的微生物体系利用培养基进行分离培养,获得纯种微生物的方法。该方法通常结合生理生化检验以及分子生物学等实验确定菌种,从而获得豆豉中的微生物多样性信息[9]。

孙森[10]利用传统培养方法对天然发酵豆豉后发酵期间的微生物进行分离培养,共纯化出4株细菌、1株酵母菌和1株霉菌,并利用平板计数法分析菌相变化,确定了后发酵过程中的优势菌分别为2株细菌(乳酸杆菌和芽孢杆菌)和1株酵母菌，细菌多样性远远高于真菌多样性。赵文鹏[11]利用传统培养方法对曲霉型豆豉后发酵期间的微生物多样性进行探究,结果也表明细菌多样性远大于真菌多样性,且细菌及真菌多样性整体呈下降趋势,并从中分离纯化出18种菌株,其中鉴定出的贝莱斯芽孢杆菌、鸡葡萄球菌、咸海鲜魏斯氏菌被确定为后发酵期间的优势菌。胡会萍等[12]同样利用传统培养方法对豆豉后发酵期间5个阶段的微生物进行分离筛选,共纯化出15株酵母菌、102株芽孢杆菌和69株乳酸菌。从中确定了6种优势有益菌,并进行了分子生物学鉴定,该结果为未来豆豉的纯种发酵提供了实践基础。

可见传统培养方法在对豆豉发酵期间的微生物多样性研究上,更侧重于了解并确定优势发酵微生物信息，同时具有简便、鉴别较准确、能够直接获得发酵菌株的优点,成为目前常用的分析手段。然而该方法也具有自身的缺陷,比如可培养的微生物较少。据研究报道,利用传统培养方法所了解的微生物信息甚至不到1%[13],因此在了解豆豉发酵期间的微生物多样性上该方法局限性较大。

1.2 梯度凝胶电泳技术

梯度凝胶电泳技术是应用较早的现代非培养技术之一,目前最流行的有两种,分别是变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE),前者应用较广泛。依据的原理是不同菌种的DNA 分子碱基序列不同,其解链温度亦不同。将提取的总DNA置于不同梯度的变性剂或不同温度的电泳环境中,当其温度达到某一DNA 片段的解链温度时,立即开始部分解链,同时DNA 分子在电泳中的迁移速度随着解链程度的增加而降低,因此不同的DNA 分子片段具有不同的迁移速度,在电泳中形成了互相分开的图谱,实现了菌种的分离[14]。最后借助分子生物学方法对分离的条带进行分析,即可获得发酵微生物的信息。

曾涛等[15]利用DGGE技术研究了永川豆豉制曲和后发酵期间的菌群动态变化。研究结果表明在制曲阶段占据主导地位的真菌为总状毛霉，细菌为乳酸乳球菌,而在后发酵期间细菌的群落结构明显复杂,曾在制曲阶段出现的优势微生物在后发酵期间急剧下降,甚至消失,同时出现了新的以枯草芽孢杆菌为主的优势细菌。李小永[16]利用DGGE技术对细菌型豆豉后发酵期间的细菌多样性进行研究,结果表明细菌多样性呈现先升高后降低的趋势,并推测出可能是营养物质及外环境的变化所致,并对分离出的15个条带进行分析,得出主要优势菌为多种不可培养细菌(UnculturedBacterium)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。而TGGE 技术在豆豉微生物多样性方面未见报道。

因此,梯度凝胶电泳技术不需要进行传统方法的培养就能检测到不可培养的微生物,且具有检测速度快、重现性强、可同时检测到多种菌株的优点,是目前研究微生物演替规律、菌群动态变化的有力工具[17]。然而该技术也存在自身缺陷,一般只能分析少数的DNA分子片段(500 bp以下)[18], 因此得到系统进化的信息比较少,对微生物群落信息的了解有限。

1.3 限制性片段多态性技术

限制性片段多态性技术(RFLP)是指利用特定的限制性内切酶对DNA 序列进行酶切,由于不同菌种的DNA 序列不同,所以酶切位点会产生差异,酶切后会产生特征性长度不一的限制性片段,而每个长度不一的限制性片段代表一种菌株,对其进行分析,即可获取微生物多样性信息[19]。目前,以RFLP技术为基础又发展出末端限制性片段多态性技术(T-RFLP)和扩增片段长度多态性技术(AFLP),其中的T-RFLP在豆豉微生物多样性研究上应用较常见。如李小永利用T-RFLP技术对细菌型豆豉后发酵期间的微生物菌群进行分析,结果表明后发酵初期微生物多样性指数较高,随后降低,在中期升高,而后降低至末期的演替规律，确定了枯草芽孢杆菌和一些不可培养细菌为主要优势菌。林榕姗[20]同样利用T-RFLP技术对细菌型豆豉后发酵期间的微生物菌群动态变化进行了研究,并对酶切产物进行了测序扫描,结果显示细菌多样性指数、丰富度在后发酵期间整体较低且稳定,说明后发酵期间细菌种类并不多,优势度分析得出后发酵前期优势菌的含量较后期高。最后由数据库鉴定可知,其中Firmicutes所占比例为80%,Bacillius所占比例为66.7%,优势菌群特征比较明显。

该技术具有重现性强、分辨率高以及可进行定性定量分析等优点,使得微生物多样性和菌群演替规律研究得到了很大发展空间。但自身也存在着一些缺点,如进行定性时,数据库不能够进行精确匹配,无法明确鉴定菌种;同时DNA 浓度、限制性内切酶用量、酶切时间等因素都在一定程度上影响RFLP的准确性[21]，使得该技术无法准确全面地反映微生物多样性信息。

1.4 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系的基础上,引入荧光基团或荧光染料,通过荧光信号出现的顺序以及强度进行实时监测PCR 全程,然后通过标准曲线对DNA 分子进行定性和定量的方法[22]。该方法具有简单、快捷、灵敏度高、可同时测定大量样品的特点,被广泛用于食品致病菌检测领域[23]。该技术在应用于发酵食品微生物多样性上常需要借助特异性引物对菌群的丰度进行监测。如赵文鹏利用该技术结合特异性引物对豆豉发酵期间主要菌群的绝对丰度进行了测定,结果显示细菌和真菌的绝对丰度呈逐渐下降的趋势,且细菌的绝对丰度远超真菌的绝对丰度,这为接下来主要微生物相对丰度的研究指明了方向。总的来说,该方法应用于豆豉微生物丰度及菌落组成的研究相对较少,其自身也存在一些缺陷,比如实验影响因素多[24],且成本高、条件的设计和引物的选用较复杂,只能有少数序列进行分析,不能够较全面反映微生物多样性信息。

1.5 高通量测序技术

高通量测序(high throughput sequencing,HTS)又称为下一代测序技术(next generation sequencing,NGS),该技术原理是对提取的总DNA 进行通用接头拼接,之后进行PCR 扩增构建文库,再对几十万至几百万条DNA 分子进行序列测定,同时获取有效测序数据,并通过软件和数据库分析,最终获得完整DNA 信息[25]。目前以Roche 454和Illumina测序平台为主流应用。该技术具有高通量、耗时短、平行分析的优点,被广泛应用于微生物菌群动态研究[26]。如Yang等利用高通量测序技术对豆豉发酵过程中的微生物多样性和菌群演替进行了研究,结果显示细菌多样性在制曲阶段不断增加,在后发酵期间先降低而后逐渐升高,并推测出这是由细菌所处环境的变化而引起的，而真菌多样性在制曲和后发酵期间都比较稳定，之后利用多元统计方法分析了微生物群落结构差异性，并从中揭示了在门和属水平上优势菌群的动态变化。Wang等[27]同样利用该技术分析了不同类型豆豉(干豆豉和湿豆豉)的细菌群落多样性,结果显示湿豆豉的细菌多样性和丰富度高于干豆豉,而干豆豉中的物种分布更加均匀，且不同类型豆豉菌落结构差异明显。所有豆豉样品共鉴定出9个门和192个属,其中有5个优势门和18个优势菌属,而芽孢杆菌可作为干豆豉的生物性标记物。目前来看,高通量测序技术在对部分低丰度及不可培养的微生物的鉴定方面,具有较其他方法更高的准确性,使其可快速、准确、全面地反映豆豉中微生物群落信息[28],正受到越来越多学者的关注。

2 挥发性成分及其检测技术

2.1 GC-MS技术

气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术是目前用于检测豆豉挥发性成分最常用的技术,该技术能够对物质进行准确的定性定量分析,是探究豆豉挥发性成分信息的有力工具。通常GC-MS技术需要联合一些前处理技术,比如固相微萃取技术(SPME)、搅拌棒吸附萃取技术(SBSE)、同时蒸馏萃取技术(SDE)、溶剂辅助风味蒸发技术(SAFE)等来实现对挥发性风味较为准确的捕捉。如Wang等[29]利用SDE-GC-MS技术对3种商业豆豉中的挥发性成分进行了探究,利用保留时间和数据库进行定性,采用内标法进行定量。结果显示,从3种商业豆豉中共检测出131种挥发性化合物,其中共有的成分为25种,较为全面地表征了3种豆豉所含的挥发性成分。李金林等[30]利用SPME-GC-MS技术对曲霉型豆豉生产过程中的挥发性成分变化进行了研究,并进行定性定量分析。结果表明,各个阶段挥发性成分分别为制曲24种、后发酵45种、干燥50种,挥发性成分主要在后发酵阶段进行大量积聚和累积,且豆豉以醛类、酯类、醇类和酚类为主体成分,并发现干燥过程对豆豉的整体风味影响不大。然而该技术在对豆豉挥发性成分研究时,仍然存在一些不足,如检测结果受前处理条件(萃取头材料选用、萃取条件)、仪器设定条件影响较大,导致重现性差,同时存在GC进样时间较长、效率不高、检测限相对较高、对痕量挥发性成分的捕捉较为困难等问题[31]。

2.2 GC-O 技术

虽然GC-MS技术能够对豆豉的挥发性成分进行较为准确的定性定量,但并不是所有的挥发性成分都对豆豉的香气有贡献作用,某些含量较低的挥发性成分反而具有较高的气味强度[32]。因此，有必要探究这些能够产生较强气味的关键挥发性成分,以便于更好地了解豆豉的特征性风味。气相-人工嗅闻(GC-O)技术就是利用人类的鼻子比现代仪器灵敏度更高的特点,去嗅闻豆豉中的关键活性香气,确定豆豉中的主体香气。该技术通常与GC-MS技术联用来共同表征豆豉的挥发性成分。如 Chen等[33]利用GC-O/MS联用技术对成品浏阳豆豉的挥发性成分进行了检测,结果显示,GC-MS共检测出55种挥发性成分,而GC-O 技术共嗅闻出29种气味峰,其中有22种气味峰被GCMS检测到,根据嗅闻出的气味强度明确了浏阳豆豉的主体香气物质为2-甲基丁醛、2-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、2,6-二甲基吡嗪、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、苯乙醛、苯乙醇、乙酸苯乙烯和丁酸苯乙酯。Wang等[34]同样利用GC-O/MS技术对永川豆豉的挥发性成分进行了表征,结果显示,利用GC-O 技术共嗅闻出51种气味峰，其中49种被GC-MS技术鉴定出来，并利用GC-O 技术进行香味稀释分析(AEDA),同时结合风味活性值(OAV)得到香气活度较高的20种化合物。在后续实验中对这20种挥发性成分进行了香气重组和遗漏实验,又从中筛选出10种化合物,并被认为是对豆豉主体香气贡献显著的化合物。总的来说,该技术能够弥补单一运用GC-MS技术所带来的不足,是目前鉴定豆豉关键风味的有力工具[35]。

2.3 GC-IMS技术

气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS)技术是根据不同的气相离子在电场中迁移速度的差异这一原理,来实现对不同基质中挥发性化合物进行检测的一项技术[36]。不同于GC-MS技术,该技术具有检测速度快、无需前处理、灵敏度高、更侧重于对痕量挥发性成分捕捉的特点[37]。Chen等[38]利用GC-MS和GC-IMS两种技术对浏阳豆豉发酵过程中的挥发性成分变化分别进行了表征。结果显示,GC-IMS技术检测出80种挥发性化合物,其中明确鉴定出50种,包括12种醇类、12种醛类、9种酯类、9种酮类、3种酸类、3种吡嗪类、2种酚类,并对该技术所建立的指纹图谱进行差异化分析,发现不同发酵时期挥发性成分差异较大,可通过挥发性成分变化进行明显的区分。通过GC-MS共鉴定出81种不同的挥发性化合物,包括醇类14种、酯类13种、酸类7种、醛类6种、酮类5种、吡嗪类7种、酚类4种、其他25种。通过对比两种技术发现,GC-IMS和GC-MS表现出不同的挥发性成分识别能力,GCMS对高浓度的吡嗪类更敏感,而GC-IMS对低浓度的醛类和酮类的敏感性更强。同时GC-MS 结果显示,醇类是L1时期的主要挥发性有机物,而GC-IMS地形图则显示为醛类和酮类，可以看出两种方法的化合物敏感性确实存在差异。GC-IMS技术由于对痕量物质的检测较为准确,因此更侧重于挥发性成分的差异化分析,在利用挥发性化合物差异区分不同发酵阶段方面则显得更有优势。

2.4 电子鼻技术

电子鼻是一种新兴的、可检测分析基质中复杂挥发性成分的电子感官仪器。不同于GC-MS和GC-IMS,该技术不能对样品中的挥发性成分进行定性定量检测,只能分析出挥发性成分的整体信息[39],且该技术通常结合多元统计分析方法对样品之间的气味进行差异化分析。如蒋立文等[40]利用电子鼻技术对毛霉型豆豉发酵过程中的挥发性成分进行了检测。结果显示,随着发酵时间的延长,10个传感器的感应值明显升高,说明随着发酵的进行,挥发性成分在不断地增加累积。结合主成分分析可以看出毛霉型豆豉前发酵与后发酵阶段样品气味差异明显,且后发酵样品具有较多的共性成分。目前,该技术具有能够极其快速检测的特点,被广泛应用于食品的真伪鉴别、质量抽检等方面[41]。在表征挥发性成分变化上,单一运用该技术对豆豉挥发性成分分析较少,所以通常需要结合GC-MS等技术。

3 豆豉微生物多样性与挥发性成分相关性分析

在研究豆豉发酵过程中微生物多样性和挥发性成分的基础上,进一步探索两者之间的相关性成为近年来学者们研究的热点话题。目前以皮尔逊、斯皮尔曼、偏最小二乘法为主要的分析方法。通过这些多元统计方法建立微生物菌群和风味代谢物之间的潜在关系。

Yang等利用双向正交偏最小二乘法(O2PLS)建立了曲霉型豆豉细菌群落和风味的潜在关联。结果显示,Illumina MiSeq测序确定了发酵过程中的6个优势属,GC技术分析得到58种风味成分,O2PLS关联分析表明,在|P|>0.8水平下,14个细菌属对42种挥发性成分产生具有重要贡献,它们分别是Ignatzschineria，Weissella，Corynebacterium_1，Lactococcus,Wohlfahrtiimonas，Atopostipes，Vagococcus，Peptostreptococcus，Tetragenococcus，Bacteroides,Kurthia, unclassified _f _Brucellaceae,Gulosibacter，norank _ f _Actinomycetaceae,并将这14个细菌属确定为核心功能菌群。

Han等[42]利用斯皮尔曼相关分析对来自11个不同厂家的韩国大酱建立了微生物群落和代谢物之间的关系,结果显示,在|R|>0.5,P<0.05水平下,3-甲基丁酸和四甲基吡嗪在部分样品中含量较高,它们与两个菌属(Staphylococcus和Bacillus)呈显著正相关,乙酸乙酯与3个菌属(Weissella,Hyphopichia和Wickerhamomyces)呈显著正相关,5种细菌属与2种真菌属都与4种以上的风味呈显著相关性。因此,这些菌属被视为与风味有关的重要菌属。

Liu等[43]利用皮尔逊相关分析对郫县蚕豆酱在发酵过程中的微生物群落及挥发性成分建立了关系。研究显示,高通量测序技术确定了66个关键菌属(平均相对丰度>0.1%),GC-MS技术鉴定出26种关键挥发性风味,皮尔逊相关性分析显示,在|P|>0.6的水平下,有36个菌属与挥发性化合物有密切的关系，并与其他风味代谢物进行了关联,共确定了9种核心微生物，它们分别是Kosakonia,Kazachstania,Debaryomyces,Lactobacillus,Myroides,Stenotrophomonas,Ochrobactrum,Wohlfahrtiimonas和Lactococcus。这一研究对探索郫县蚕豆酱的最佳发酵剂以及独特风味的形成机制提供了理论基础。然而目前对豆豉的关键菌属和代谢物进行关联分析的相关报道还比较少,这将会成为进一步研究的热点。

4 总结及展望

豆豉因具有丰富的功能活性物质和独特的口味成为目前广大学者研究和开发的热点。发酵菌种、生产工艺、发酵条件等都会影响豆豉的最终质量,许多豆豉生产厂家仍然停留在传统工艺制作上,依旧存在豆豉质量参差不齐、发酵周期长等制约企业发展的技术难题,因此亟需研发优良发酵剂,优化生产工艺,在保持原有风味的前提下,实现工业化、标准化生产。

利用先进的技术对豆豉进行微生物群落演替与代谢物成分相关性研究,是目前探索优良微生物资源、风味形成机制的基本研究,也为未来发酵菌种筛选与纯种发酵、工艺优化提供了基本理论。此后应继续加大对豆豉发酵菌种的研究,进一步使豆豉生产产业化、标准化，让我国的传统食品豆豉可以走出国门,进一步激发市场潜力。