傅里叶红外光谱结合化学计量学的渣驯优劣鉴别研究

李子仪， 李瑞兰， 李灿琳， 王柯入， 范久余， 古 锐*

1. 成都中医药大学民族医药学院， 四川 成都 611130 2. 成都中医药大学药学院， 四川 成都 611130 3. 重庆市中药研究院， 重庆 400065

引 言

藏药“渣驯”， 意译为“岩精”， 为岩石中流出的一种黑色有机质与鼯鼠属、 鼠兔属动物粪便的混合物[1]， 药材性状见图1(a—d)。 渣驯具有治疗肝病、 胃病的功效， 是治疗肝病的首选药物之一[2-3]， 在其他医学体系中也有着广泛的使用， 如在阿育吠陀和尤纳尼医学体系中主要用于治疗阳痿、 增强体质， 其提取物在美国、 俄罗斯等多个国家广泛使用。 国内外渣驯药理实验也表明渣驯具有抗肾毒性[4]、 补充体力[5]、 抗炎[6]、 治疗肝损伤等[7]作用， 具备广阔的临床应用潜力。 渣驯传统等级区分仅根据粪便比例判别， 粪粒少则质优。 但药材市场出售和藏医院使用的通常为渣驯膏， 颜色均为棕黑色， 仅根据传统性状判断方法无法区分其质量优劣。

图1 不同等级渣驯(a)： Ⅰ级； (b)： Ⅱ级； (c)： Ⅲ级； (d)： 代用品Fig.1 Zhaxun of different grades(a)： Grade Ⅰ； (b)： Grade Ⅱ； (c)： Grade Ⅲ； (d)： Substitute

随着现代技术发展， 出现了更多的药材鉴别方法， 比如薄层色谱鉴别[8]、 理化鉴别[9]、 分子鉴定[10]、 荧光光谱鉴别[11]、 高效液相色谱鉴别[12]等方法， 但这些方法存在耗时长， 效率低， 价格昂贵等缺点。 近红外光谱(NIRS)是传统药材鉴别的有效方法， 但NIRS受温湿度影响明显， 特征信息较少， 如赵明明等采用NIRS能够区分代用品与其他等级渣驯[13]， 但无法区分其他3个等级渣驯。 综上， 现有的鉴别技术存在检测时间长， 检测效率低等问题， 近红外光谱技术获取信息量较少， 仍没有完全区分不同等级渣驯， 因此有必要进一步研究渣驯优劣快速评价方法。 FTIR是目前发展较快且具有良好应用前景的分析技术之一， 根据光谱图的不同特征， 鉴别未知物质和特殊化学官能团[14]， 与近红外光谱测定波数范围不同， 在中药的有效成分、 产地鉴别等有着广泛的应用[15]。 通过傅里叶变换红外光谱技术为渣驯药材及渣驯膏优劣鉴别提供研究基础， 为建立渣驯(膏)质量标准提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

安捷伦Cary610显微红外光谱仪(DTGS检测器， 美国安捷伦公司)； BSA124S电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)； PC-5压片机(天津市精拓仪器科技有限公司)； 溴化钾(KBr)(光谱纯， 成都市科隆化学品有限公司)； DHG-9245A鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)[16]。

1.2 材料

通过药材市场购买、 产地收购及产地自采的方式共收集56批次渣驯药材及代用品样品， 52批作为测试集， 4批作为外部验证集。 成都中医药大学古锐教授根据药材的色泽和断面粪粒数量， 将渣驯分为4个等级， Ⅰ级为传统鉴别的优等品， 质重色黑， 极少粪粒， Ⅱ级次之[13]， Ⅲ级断面粪粒较多， 质较轻， 代用品为粪粒凝结团块， 表面黄棕色或黑棕色， 样品信息见表1。 依据《六省区藏药标准》中渣驯炮制标准方法， 将得到的渣驯干膏打粉后过80目筛， 备用。

表1 渣驯药材来源信息表Table 1 Sample information form of Zhaxun

1.3 方法

1.3.1 实验环境

渣驯红外图谱测定在成都中医药大学中医药创新研究院实验室完成， 室内温度(25±2) ℃， 空气湿度57 RH%。

1.3.2 样品制备及测定

将渣驯膏粉末装入西林瓶中在50～55 ℃烘箱中过夜去除水分， 玛瑙研钵中先加入KBr粉末， 作为空白对照。 烘干后的渣驯膏粉末与KBr以2 mg∶100 mg的比例混合研磨至细粉， 粉末均匀后在压片机中压片， 每个渣驯样品均制备3个样片。 使用红外光谱仪测定薄片透光度， 取平均图谱， 每个样品扫描32次， 扫描时扣除H2O和CO2[17]。

1.3.3 数据处理

通过OMINIC 8.2软件测得试样红外光谱， 图谱预处理方法见图2， 通过预处理得到校正光谱， 同一等级所有渣驯的校正红外光谱图得到各等级渣驯平均图谱； 各等级平均图谱经过二阶导数转化， 获得对应各级别样品二阶导数红外光谱； 对各等级的红外平均光谱和二阶导数光谱进行分析， 得到各等级渣驯红外光谱峰指标信息， 从而分析各等级渣驯峰差异[18]。

基于二阶导数图谱数据， 分别采用SPSS 21.0 软件进行HCA(hierarchical cluster analysis)分析， SIMCA 14.0软件进行PCA(principal component analysis)、 PLS-DA(partial least squares iscriminent analysis)分析， 数据处理流程见图2。

图2 数据处理流程图Fig.2 Flow chart of data processing

1.4 方法学考察

选取编号“1-1”的样品进行方法学考察， 验证方法可行性[19]。

1.4.1 精密度实验

按“样品制备与测定”项中方法， 连续重复扫描5次。

1.4.2 稳定性实验

按“样品制备与测定”项中方法， 每隔10 min扫描1次， 总共扫描5次。

1.4.3 重复性实验

按“样品制备与测定”项中方法， 按“1.3.2”项方法分别压制5片。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

精密度实验中， 不同等级红外图谱的相关系数为0.998 6～0.999 2， RSD=0.090(n=5)， 精密度良好； 稳定性实验中， 不同等级红外图谱的相关系数为0.999 7～0.999 8， RSD=0.017(n=5)， 稳定性良好； 重复性实验中， 不同等级红外图谱的相关系数为0.999 1～0.999 7， RSD为0.044(n=5)， 重复性良好。

2.2 不同等级渣驯红外光谱比较

不同等级渣驯的平均红外光谱见图3， 四个等级渣驯红外光谱相似度高。 各等级渣驯指纹吸收区为1 800～400 cm-1。 指纹区范围内， 1 800～1 400 cm-1的峰表明， 该区域峰表征苯环骨架伸缩振动和O—H面内弯曲振动， 1 300～1 000 cm-1峰表征， 该区域峰的振动形式为C—O伸缩振动， 1 000～500 cm-1峰表明， 该区域峰的振动形式为苯环C—H的面外弯曲振动和酚类O—H的面外振动。

图3 四个等级渣驯平均红外光谱图Fig.3 Average infrared spectrum of Zhaxun of four grades

2.3 不同等级渣驯二阶导数对比

图4中四个等级渣驯的整体吸收区域相似度较高， 对于二阶导数光谱中的指纹区(1 800～400 cm-1)进行放大， 如图5， ①号区域内， 1 768 cm-1附近Ⅰ等级渣驯和Ⅱ等级渣驯峰强度明显强于Ⅲ等级渣驯和渣驯代用品， 1 779 cm-1附近仅有Ⅰ等级渣驯和Ⅱ等级渣驯有吸收峰。 ②号区域内， 1 660 cm-1附近Ⅰ， Ⅱ和Ⅲ级渣驯均出现吸收峰， 仅代用品渣驯无吸收峰。 ③号区域内， 吸收峰强度变化与渣驯等级具有明显关系， 传统分级品质越好的峰强度越大。 ④号区域内， 仅渣驯代用品在1 257 cm-1具有吸收峰， 其他等级渣驯均无吸收峰。 ⑤号区域内仅Ⅱ、 Ⅲ等级样品具有吸收峰， Ⅰ等级样品和代用品无吸收峰。 ⑥号区域内仅代用品无吸收峰出现， Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ等级样品均有吸收峰。 ⑦号区域内吸收峰差异与渣驯等级具有明显关系， 传统分级品质越好的峰强度越大。 1 660 cm-1附近仅代用品渣驯无吸收峰， 1 257 cm-1仅代用品具有吸收峰， 均可作为代用品渣驯的鉴别依据； ③号区域内及⑦号区域吸收峰差异均与传统分级相关， 品质越好的峰强度越大， 可作为多批次渣驯验证区域。

图4 四个等级渣驯二阶导数平均红外光谱Fig.4 Second derivative average infrared spectra of Zhaxun of four grades

图5 四个等级渣驯指纹区二阶导数平均红外光谱Fig.5 Second derivative average infrared spectra of fingerprint areas of Zhaxun of four grades

2.4 化学计量学分析

2.4.1 主成分分析(PCA)

PCA结合二阶导数生成四个等级渣驯得分图， 结果如图6所示， Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ等级渣驯区分度小， 仅代用品渣驯区分度较高， 结果表明PCA能够区分代用品渣驯与其他等级渣驯。

图6 四个等级渣驯PCA三维得图Fig.6 3D scattered plot of PCA of Zhaxun of four grades

2.4.2 偏最小二乘法分析(PLS-DA)

通过传统分级法进行分组， 采用PLS-DA进行组别标注， 得到四个等级的PLS-DA三维得分图， 如图7所示， Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ等级与代用品出现分离， 聚类效果好， 四个等级渣驯单独聚类， 且具有一定分布规律， 代用品渣驯与其他三个等级渣驯差异较大。 PLS-DA对渣驯分组进行预测结果更易区分。

图7 四个等级渣驯PLS-DA三维得分图Fig.7 3D scattered plot of PLS-DA of Zhaxun of four grades

2.5 外部验证实验

将自采的4个样品ZX1-19， ZX2-20， ZX3-21和ZX4-16按“2.3”中构建的4个等级渣驯的PLS-DA鉴别方法进行鉴别。 从外部验证结果的三维图(图8)能够看出， ZX1-19明显与Ⅰ等级渣驯聚为一类， ZX2-20明显与Ⅱ等级渣驯聚为一类， ZX3-21明显与Ⅲ等级渣驯聚为一类， ZX4-16明显与代用品渣驯聚为一类。 外部验证的结果证明“2.3”中建立的PLS-DA模型鉴别方法对4个等级渣驯具有良好的鉴别能力。

图8 外部验证实验的PLS-DAFig.8 3D scattered plot of PLS-DA

2.6 聚类分析

聚类分析(hierarchical cluster analysis, HCA)采用Ward聚类法， 距离为25时， 四个等级渣驯聚为2类， Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ等级渣驯为一类， 代用品渣驯单独聚为一类， 与其他三个等级渣驯有明显差异； 距离为4时， Ⅲ等级中12批样品聚为一类， 其他少数Ⅲ等级渣驯与Ⅰ、 Ⅱ等级渣驯聚集， 聚类结果见图9。 表明这几批Ⅲ等级渣驯与Ⅰ、 Ⅱ等级渣驯亲缘关系较近； Ⅰ、 Ⅱ等级渣驯聚类不明显， 化学成分差异可能较小。

图9 四个等级渣驯的HCA图Fig.9 Diagram for HCA of Zhaxun

3 结 论

3.1 不同化学计量学方法对不同等级渣驯差异性的分辨能力

通过红外光谱技术结合化学计量学， 完成对不同等级渣驯的的优劣鉴定及真伪鉴别， 红外光谱表明渣驯的指纹鉴别区域位于1 800～400 cm-1内， 其中代用品与其他等级渣驯差异较大。 二阶导数全波段数据分析， 渣驯样品间差异较小， 1 660 cm-1附近仅代用品渣驯无吸收峰， 1 257 cm-1仅代用品具有吸收峰， 均可作为代用品渣驯的鉴别依据； ③号区域内及⑦号区域吸收峰差异均与传统分级相关， 品质越好的峰强度越大， 可作为多批次渣驯验证区域。

PCA方法在未知分组下， 能将代用品渣驯与正品渣驯区分， 无法区分其他三个等级渣驯； PLS-DA分析方法能够将四个等级渣驯较好地区分， 更好区分各组特征变量。 HCA结果显示代用品渣驯单独聚类， 与其他三个等级渣驯不同， Ⅲ等级渣驯中有12批样品聚为1类， 其他7批样品与Ⅰ、 Ⅱ等级渣驯混杂， 推测Ⅲ等级渣驯可能与Ⅰ、 Ⅱ等级渣驯有差异性， 同时化学成分具有一定相似性； Ⅰ、 Ⅱ等级渣驯化学相似度较高。

PCA为无监督分类， 适用于样品未知分类情况， 根据光谱信息直接进行分类； 渣驯样品未分组时， 使用PCA进行判别， 由于各组光谱信息差异较小， 不能完全区分不同等级渣驯， 仅能区分光谱信息差异较大的代用品渣驯。 PLS-DA为监督分类， 通过提前分组， 选择特征参数进行分类； 对渣驯样品进行分组， 根据每个样品光谱信息对渣驯进行划分， 可以利用已知光谱信息验证其他未知样品。 对已知渣驯样品进行分组， 获取不同组间光谱信息差异， 使用未知样品时根据已有样品光谱信息进行等级判别， 可以有效鉴别不同等级渣驯。

3.2 傅里叶变换红外光谱技术结合PLS-DA分析能够快速判断渣驯质量等级

监督分析方法中PLS-DA模型对四个等级渣驯区分良好， 外部验证试验结果显示， ZX1-19， ZX2-20， ZX3-21和ZX4-16都正确地与相应品种聚为一类， 证明PLS-DA方法对四个等级渣驯具有良好的鉴别能力。 本研究使用的渣驯样品均需熬膏后使用， 不但有助于鉴定渣驯药材， 同时也对渣驯膏的品质评判提供了依据。