野生黑果枸杞叶片不定芽诱导研究

伊特格乐，燕 兴，贺 平，贾晨光，白玉娥

（1.内蒙古农业大学林学院，内蒙古 呼和浩特 010019；2.鄂尔多斯市杭锦旗林业发展中心，内蒙古 鄂尔多斯 017499；3.呼和浩特市林业和草原保护中心，内蒙古 呼和浩特 010011）

黑果枸杞（LyciumruthenicumMurr.），茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium L）多年生棘刺灌木，主要分布于我国青海、新疆、甘肃、宁夏、内蒙古等地的盐碱地、沙漠、戈壁，是一种抗旱、耐盐碱植物。

本研究以野生黑果枸杞叶片为外植体材料，筛选不同生长调节剂比例培养基，仅用1 种培养基便完成了愈伤组织诱导、不定芽分化试验过程，简化了操作步骤，将培养时间控制在35 d 内，并显著提高了不定芽分化系数，为黑果枸杞的遗传转化、工厂化育苗及资源保护提供了技术支撑。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

试验材料取自内蒙古自治区阿拉善盟奥伦布拉格镇黑果枸杞种质资源收集圃的青海种源黑果枸杞2 年生实生苗。因野外距离实验室较远，2020 年4 月末，将无病虫害萌蘖苗移栽到内蒙古农业大学育种实验室。6月中旬采集嫩叶。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒

将试验外植体材料分为A、B、C、D 共4 个组，均先用洗洁精水浸泡3 min，然后采取不同消毒处理。A 组用流动水冲洗2 h 作为对照，B、C、D 组冲洗2 h 过程中，每隔30 min 用75%酒精分别浸泡10 s、20 s、30 s，洗去残留酒精后继续流动水冲洗，每组3 次重复。

将处理好的叶片放置在超净台上，用75%的酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3 次以上，再用2%的NaClO 浸泡8 min，无菌水冲洗5 次，获得无菌外植体材料。7 d后统计存活率、死亡率、污染率。

以上试验重复3 次，每7 d 观察拍照。存活率、死亡率和污染率相关计算公式如下。

1.2.2 不同生长调节剂组合诱导愈伤及不定芽分化

MS 为基本培养基，以0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.6 mg/L NAA 不同配比，设定12 个不同生长调节剂组合。将叶片切成长方形，在表面划3～4 个伤口，接种到培养基上。每瓶接种2 个外植体，共20 瓶。暗培养，20 d 左右统计愈伤组织诱导率，35 d 左右统计不定芽诱导率及不定芽分化系数。以上试验重复3 次，每7 d 观察拍照。相关计算公式如下。

1.3 数据分析

利用Excel 和SPSS 22.0 软件统计分析数据。

2 结果与分析

2.1 叶片外植体消毒方法筛选

从表1 可以看出，用流动水冲洗叶片时，75%酒精溶液浸泡外植体20 s 的C 组外植体存活率显著高于其他处理。浸泡20 s 的C 组污染率为2.5%，比对照组污染率降低32.5%；经过30 s 浸泡处理的D 组污染率最低，为1.25%，但死亡率最高，达到20%，明显对叶片造成了伤害。用流动水冲洗外植体2 h 的过程中，每隔30 min 用75%酒精处理外植体20 s，能显著降低外植体的死亡率和污染率，而存活率比未经过酒精浸泡处理提高了31.25%。综合比较认为，最佳消毒方法为C 组，即叶片在流水冲洗时，每隔30 min 用75%酒精溶液浸泡20 s，将处理好的叶片放置在超净台上，再用75%的酒精浸泡30 s，无菌水冲洗，2%的NaClO 浸泡8 min，无菌水冲洗5 次。

表1 不同消毒处理对黑果枸杞叶片外植体污染的影响

2.2 不同生长调节剂组合对叶片诱导愈伤及不定芽分化的影响

由图1 可知，外植体接种到添加不同浓度生长调节剂的MS 培养基上，3～4 d 后叶片开始明显膨大，颜色由深绿色变为浅绿色，多数叶片出现卷曲；经过10 d左右，叶片划伤处开始产生愈伤组织。

图1 A6 培养基上不定芽诱导情况

由表2 可知，NAA 浓度同一条件下，6-BA 浓度不同，外植体愈伤组织诱导率、不定芽诱导率和不定芽分化系数均存在显著性差异。随着6-BA 浓度降低，愈伤诱导率、不定芽诱导率明显增加，且褐化现象减少；当6-BA 浓度达到1.5 mg/L 时，愈伤增殖和不定芽分化受到抑制，出现褐化等现象。因此，愈伤诱导率达到最大的培养基组合为MS+0.6 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA。

表2 不同生长调节剂浓度对不定芽诱导的影响

不定芽分化情况显示，6-BA 浓度在0.1～0.5 mg/L时，随着NAA 浓度降低，不定芽分化系数总体呈增加趋势；6-BA 浓度在1～1.5 mg/L 时，不定芽分化系数随着NAA 浓度降低而降低。在0.3 mg/L NAA、0.5 mg/L 6-BA 的组合条件下，不定芽分化系数可达22.94，在该培养基培养20 d 左右时，愈伤组织分化出4～5 个白色健壮的芽，30 d 时分化出大量健康的芽。因此，诱导不定芽分化的最佳培养基为MS+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA。

综合总体生长情况，如果采用同一培养基诱导愈伤协同不定芽分化，最佳组合为A6 组合，即MS+0.3mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA。

3 讨论

外植体的选择在植物离体培养中至关重要。相关研究中，黑果枸杞组培多数以种子播种的无菌苗获得茎尖、叶片等外植体，此方法不利于保持母本性状，而后期出现以带芽茎段、叶片等作为外植体材料。前期研究发现，黑果枸杞叶片类似海绵状，老叶片较嫩叶更易粘附空气中细菌和污渍，因此本研究采用野生黑果枸杞嫩叶。

外植体的消毒是植物离体培养成功的前提。孙晓红等（2016）[1]以0.1%氯化汞消毒叶片，几乎无感染。胡相伟等（2015）[2]利用75%酒精和0.1%氯化汞溶液（加1～2 滴吐温20）依次处理1 年生休眠枝条，得到无菌外植体。

氯化汞灭菌效率高，但属于剧毒药物，被排除。酒精消毒时间太短，不能清除干净附在外植体表面的杂质和各种微生物，易污染；酒精消毒时间太长，会破损外植体表面进而受伤害。因此，本研究采用75%酒精每隔30 min 时浸泡20 s 的多次短时间重复的消毒方法获得黑果枸杞无菌外植体。

试验结果表明，采集的嫩叶最佳消毒方法为流水冲洗外植体2 h，期间每隔30 min 用75%酒精处理外植体20 s，将处理好的叶片放置在超净台上再用75%的酒精浸泡30 s，无菌水冲洗，2%的NaClO 浸泡8 min，无菌水冲洗5 次。该方法污染率2.50%，死亡率3.75%，存活率95.00%，存活率比对照提高31.25%。

影响植物再生频率的主要因素是培养基添加的生长调节剂含量。Li Yuanyuan 等（2017）[3]研究结果显示，黑果枸杞丛芽增殖最佳培养基为MS+0.2 mg/L KT+0.02 mg/L NAA，增殖系数为3.83，丛芽健壮且无玻璃化现象。孙晓红等（2016）以叶片为材料的研究表明，添加1.0 mg/L 6-BA 和0.2 mg/L NAA 的MS 培养基，愈伤诱导率可达100%。本研究显示，对于黑果枸杞叶片愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+0.6 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA，诱导率达97.78%；对于不定芽分化而言，6-BA浓度在0.1～0.5 mg/L 时，随着NAA 浓度降低，不定芽分化系数总体呈增加趋势，当6-BA 浓度在1～1.5 mg/L时，不定芽分化系数随着NAA 浓度降低而降低。本研究中叶片愈伤诱导和不定芽分化采用同一培养基，最佳生长调节剂组合为MS+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，暗培养，愈伤诱导率97.22%，愈伤继续培养20 d 左右开始分化不定芽；15 d 后统计，不定芽诱导率97.38%，不定芽分化系数22.94。这样可以将整个繁育期整体缩短到35 d 内，较前人研究更满足黑果枸杞快繁工厂化生产的需求。