主动脉瘤动物模型研究进展

臧晗伟 杨丽娟 杜昭启 李伟

1滨州医学院附属医院心脏大血管外科，滨州 256603；2滨州医学院附属医院医学研究中心，滨州 256603

主动脉瘤是指主动脉局部或弥漫性的扩张，通常主动脉直径超过正常直径的50%即可诊断为主动脉瘤，绝大多数的主动脉瘤患者无明显症状，但瘤体发生破裂后病死率极高［1-2］。近年来，受社会压力和不良生活习惯的影响，主动脉瘤的患病率呈上升趋势，随着影像学技术的发展和医疗资源的改善，主动脉瘤的就诊率和检出率也相应提高。介入技术的逐步成熟及广泛应用使得大部分患者得到了及时的救治。但该病当前并无有效的预防和药物治疗手段，因此研究疾病的发病机制、发现潜在治疗靶点是主动脉瘤防治的重中之重。

不同于其他组织，主动脉瘤临床样本的获取难度较大，因此，主动脉瘤的研究主要通过细胞或动物实验进行，稳定、合理的主动脉瘤模型是开展科学研究的基础。目前，主动脉瘤动物模型包括药物诱导模型、基因工程模型和手术模型，其中药物诱导模型最为常见。不同的模型模拟了不同的发病机制，呈现不同的病理表现，适用于不同的实验研究，且动物存活率、造模费用等也大不相同，本文就主动脉瘤动物模型的构建方法及优缺点等进行综述。

主动脉瘤概述

1.主动脉瘤的临床诊疗

主动脉瘤根据发病部位可分为胸主动脉瘤和腹主动脉瘤［1-2］。无论是胸主动脉瘤还是腹主动脉瘤，在早期多无明显症状，多因查体发现，部分患者可在后期因瘤体压迫临近组织器官或破裂后发现。而夹层动脉瘤作为主动脉瘤的一种特殊类型，在疾病的早期即可表现为剧烈的疼痛，主动脉夹层发病急骤，破裂风险高，需尽早治疗。彩超检查由于费用低、无创，是筛查主动脉瘤最常用的影像学手段，主动脉CT血管造影（CTA）可以较为精确地显示出动脉瘤大小、形态、附壁血栓、主动脉分支血管受累状况，是主动脉瘤诊断的金标准。

无论是胸主动脉瘤还是腹主动脉瘤，手术均为其首选治疗方法［1-2］。手术又包括介入手术及开放手术两种，对于病变位于升主动脉的患者而言，常需选择创伤较大、风险较高的开放手术，术前需严格评估瓣膜功能，明确是否需同期行瓣膜置换，术中常需切除整段病变血管并进行人工血管置换。位于主动脉弓、降主动脉或腹主动脉的动脉瘤多采用介入手术，其优点是创伤小、操作时间短，术后恢复快。

2.主动脉瘤的病理特征及发病机制

主动脉瘤的主要病理表现包括：细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解、血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的凋亡及表型转化、管壁炎症细胞浸润，这些病理表现相互作用，共同参与了疾病的进展。ECM由弹力蛋白和胶原蛋白构成，是构成主动脉中膜的重要成分，负责维持血管稳态。处于合成态的VSMCs可产生大量基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），并作用于ECM，促使弹力蛋白和胶原蛋白降解，诱导腹主动脉瘤发生［3］。VSMCs是构成主动脉中膜的主要细胞成分，在主动脉瘤疾病进程中，VSMCs发生异常凋亡，并从收缩态向合成态转化，导致弹性蛋白和胶原合成减少，降解增多，动脉管壁发生退化［4］。炎症细胞浸润是主动脉瘤发病过程中的另一重要病理表现，在主动脉瘤患者的主动脉壁中，可观察到巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等多种炎症细胞，炎症细胞分泌的多种细胞因子和趋化因子可诱导MMP的活化，引起ECM降解和VSMCs凋亡［5］。

主动脉瘤的病因及发病机制当前并不明确，主要危险因素包括年龄、性别、吸烟、肥胖、高血压。除此之外，主动脉瘤还受遗传因素影响，如与FBN1基因突变相关的马凡综合征（Marfan syndrome，MFS）［6］，与MYH11基因相关的家族性胸主动脉瘤及夹层［7］，洛伊斯-迪茨综合征（Loeys-Dietz syndrome，LDS）患者的基因突变类型则可以分为5种亚型，分别是转化生长因子-β（TGF-β）受体1和2基因（TGFBR1、TGFBR2）的突变，TGF-β 途径中的 TGFB2、TGFB3以及SMAD3基因的突变［6］。

主动脉瘤模型

与胸主动脉瘤动物模型相比，腹主动脉瘤的动物模型较多，也比较成熟。研究表明，在某些腹主动脉瘤的建模过程中，也能观察到胸主动脉瘤的发生，但发病率较低。目前应用较多的建模方法主要包括药物诱导法、基因修饰法和手术法等。

1.药物诱导模型

药物诱导模型是通过局部或全身应用药物，诱导动物形成主动脉瘤。常用药物有氯化钙（CaCl2）、弹性蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE）、血 管 紧 张 素 Ⅱ（angiotensin-Ⅱ，AngⅡ）、β-氨基丙腈（β-aminopropionitrile monofumarate，BAPN）等，这些药物可单独使用，也可联合应用来诱导模型的形成，而不同药物诱导模型的形成机制、病理表现及药物使用方法各不相同。

1.1.CaCl2浸润法诱导模型

CaCl2可引起主动脉中膜血管平滑肌的丢失和内膜血管内皮细胞的损伤，使管壁增厚、钙化，弹性纤维断裂，同时还能引起炎症细胞（包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞）浸润管壁，促使动脉瘤形成［8］。1988年Gertz等［9］使用CaCl2浸润兔颈总动脉成功建立了颈总动脉瘤的动物模型；在2000年，Chiou等［10］首次使用该方法在C57BL/6小鼠建立了腹主动脉瘤的模型，他们使用0.68 M CaCl2浸泡的湿纱布覆盖小鼠的腹主动脉10 min，于术后21 d观察到了腹主动脉瘤的形成。此后经过多次改良，现已广泛应用。

该模型手术方式简单，小鼠麻醉后，取腹部正中切口，游离位于双侧肾动脉至髂动脉分叉处的主动脉，暴露主动脉外膜，使用CaCl2浸泡的纱布湿敷后，使用生理盐水冲洗腹腔后关腹，实验所需CaCl2浓度及孵育时间在大鼠和小鼠差异较大，小鼠可选用1 mol/L CaCl2孵育50 min，术后14 d就可发现腹主动脉扩张。大鼠则可采用1 mol/L CaCl2溶液孵育主动脉10 min，饲养28 d观察成模情况［8，11］。该模型具体机制并不明确，目前认为血管浸润CaCl2后，游离的钙离子转运入细胞内，在VSMCs碱性磷酸酶的催化下，钙离子转化为磷酸钙，由于钙离子与弹性蛋白亲和力较高，磷酸钙可在弹性蛋白网上沉淀，引起弹性纤维的断裂［12-13］。该模型可模拟人腹主动脉瘤平滑肌细胞凋亡、炎症细胞浸润、弹性纤维钙化等特征，但该方法诱导的模型不会破裂，且不会形成粥样硬化及附壁血栓，与人腹主动脉瘤的病理特征有一定差别。

1.2.PPE灌注法诱导模型

1990年Anidjar等［14］经腹主动脉灌注PPE 2 h成功建立了大鼠的腹主动脉瘤模型。2002年国内学者将PPE的灌注时间缩短到了30 min，模型成功率在90%左右，灌注时间超过30 min，延长灌注时间，模型成功率无明显变化［15］。Pyo等［16］在2000年改进建模方法，成功将该方法应用于小鼠，并将灌注时间缩短至5 min。

PPE能穿透管壁中层，造成弹性纤维的损伤，引起局部腹主动脉扩张。病理切片发现，灌注后的第1周弹性纤维无明显损伤，灌注后第2周开始，管壁出现明显的弹性纤维降解和炎症细胞浸润，巨噬细胞和中性粒细胞是主要的炎症细胞，并且检测到了MMP-2和MMP-9的表达增加［16］。

该模型的手术操作要求较高，且在灌注过程中存在PPE渗漏、血管破裂等风险，对手术者的操作要求高。此种建模方法可选择C57BL/6J小鼠或Wistar大鼠作为实验动物，建模时需暴露双侧肾动脉至髂动脉分叉处的腹主动脉，暴露区上下两端腹主动脉使用丝线结扎，插入灌注针头进行灌注。C57BL/6小鼠可使用1.5 U/ml的PPE 30 µl灌注5 min，Wistar大鼠可使用50 U/ml的PPE 1 ml灌注30 min，灌注结束后冲洗腹腔并逐层关腹，术后第14天可观察到动脉瘤［15-17］。该模型无法诱导形成主动脉夹层、动脉粥样硬化和附壁血栓，动脉瘤破裂率也较低，但是其组织切片可观察到炎症细胞浸润和中膜的降解，该病理特点与人动脉瘤病理表现相似。

1.3.AngⅡ诱导的模型

AngⅡ诱导形成主动脉瘤是当前常用的建模方法，该方法于2000年被Daugherty等［18］报道，实验动物常选择载脂蛋白E缺失（ApoE-/-）小鼠或低密度脂蛋白受体缺陷（LDLR-/-）小鼠［19］，但也有选择野生型C57BL/6小鼠的报道［20］。AngⅡ进入小鼠体内后可损伤主动脉内膜，血液由损伤处进入管壁，形成主动脉壁间血肿，最终引起血管扩张［21］。苏木精-伊红（HE）染色提示主动脉管壁增厚，中膜及外膜可见炎症细胞浸润，弹力纤维染色还可观察到弹力纤维的降解［22］。

将含有AngⅡ的微量泵植入小鼠背部皮下，以1.44 mg（/kg·d）的剂量持续泵入，术后高脂饲料喂养28 d成瘤［23］。AngⅡ诱导的动脉瘤病理表现与人主动脉瘤病理特征相似，可见主动脉中膜降解、主动脉扩张、伴有动脉粥样硬化和壁内血栓的形成。该方法手术创伤较小，操作简单，缺点是人类腹主动脉瘤多位于肾下方，而本模型主要形成肾上型腹主动脉瘤，且因为需要使用微量泵及转基因鼠，实验费用较高。

1.4.BAPN诱导的动物模型

BAPN是一种赖氨酰氧化酶（Lox）强效抑制剂，Lox由VSMCs释放，能够氧化胶原和弹性蛋白的赖氨酸残基，使这些纤维性蛋白共价交联产生ECM，BAPN能竞争性地结合弹性蛋白或氨基烷基，抑制弹性蛋白和胶原蛋白交联，使主动脉中膜发生退化，最终形成夹层［24］。组织学可见弹力纤维破坏、数量减少，血管壁变薄和炎症细胞浸润［25］。

1952年I.V. Ponseti等发现，将山黧豆种子及正常饲料按照1∶1的比例混合饲养大鼠，5～9周后部分大鼠发生夹层破裂而死亡，提示山黧豆中的某种成分可致主动脉夹层发生，随后的研究证实导致主动脉夹层的有效成分为BAPN，从此，BAPN被逐步运用于动脉瘤模型的制作［26］。BAPN主要诱导夹层动脉瘤的形成，病变多位于胸主动脉，而腹主动脉较少见［25］。因为Lox活性可随着年龄增长而降低，成年动物使用BAPN处理后可诱导血管硬化和弹力纤维降解，但并不能诱导主动脉瘤的形成，因此该模型多选择2～3周的雄性C57BL/6小鼠［27-29］。此方法动脉瘤破裂和动物死亡风险较高，但建模费用低，操作简单。

1.5.醛固酮受体激动剂加高盐饮水诱导的模型

乙酸脱氧皮质甾酮（deoxycorticosterone acetate，DOCA）是醛固酮的前体，Liu等［30］在使用DOCA和盐诱导小鼠高血压时发现部分小鼠因主动脉瘤破裂而死亡，提示DOCA或醛固酮加高盐饮水可诱导小鼠动脉瘤形成。具体方法为：将50 mg的DOCA缓释药片植入10月龄的C57BL/6J小鼠背部，同时给予含有0.9%氯化钠（NaCl）和0.2%氯化钾（KCl）的水饲养3周即形成动脉瘤，此方法诱导形成的模型，腹主动脉瘤、胸主动脉瘤和主动脉瘤破裂的发生率分别为62%、44%和18%，且产生胸主动脉瘤的小鼠均合并有腹主动脉瘤［30］。由于DOCA是醛固酮的前体，该团队尝试200 µg（/kg·d）的醛固酮加高盐饮水饲养动物，也诱导形成了主动脉瘤。与DOCA和盐诱导的主动脉瘤相比，醛固酮和盐诱导的主动脉瘤多位于肾上腹主动脉，且主动脉瘤破裂率更高。该模型有明显的鼠龄限制，10月龄小鼠主动脉瘤发病率及瘤体最大径明显高于10周龄小鼠。由于醛固酮对肾素-血管紧张素-醛固酮系统有负反馈调节作用，而该系统可引起高血压升高，为排除血压对实验的影响，研究者使用依那普利和洛沙坦阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统的升压作用，发现动脉瘤的发生率和瘤体扩张程度无明显变化，而应用醛固酮受体拮抗剂螺内酯则能明显缩小主动脉瘤的体积，降低发病率，说明此类动脉瘤的形成取决于醛固酮的作用，而非血压的升高［31］。

此模型造模方法简单，且与人主动脉瘤的病理表现相似，均观察到弹力纤维降解、MMP分泌增加、巨噬细胞等炎症细胞浸润、VSMCs凋亡和主动脉血管壁重塑等。

1.6.多种药物联合诱导的模型

多种药物联合诱导的模型是指为提高模型成功率，联合应用2种或2种以上药物诱导构建主动脉瘤模型。目前最常用的方法是Tanaka等［32］提出的在PPE灌注的基础上联合CaCl2局部浸润的方法，在进行PPE灌注的过程中使用CaCl2纱布湿敷主动脉20 min，4周后可成瘤，成功率可达到92.7%。为研究吸烟对主动脉瘤的影响，有学者通过微量泵将4 mg（/kg·d）的尼古丁和0.72 mg（/kg·d）的AngⅡ泵入小鼠体内28 d后，发现二者联合诱导小鼠腹主动脉瘤的成功率显著高于单独应用AngⅡ组［33］。除此之外，还有部分学者使用AngⅡ联合BAPN建立主动脉瘤模型，通过AngⅡ腹腔注射联合饮用BAPN水溶液的方法构建出的主动脉瘤模型，相较于单独使用一种药物的方法而言，模型成功率明显提高，达到了80%［34］。多药物联合应用显著提高了动脉瘤的扩张比率和发生率，但也面临死亡率升高的风险。不同药物诱导出的主动脉瘤其病理表现也不同，因此通过联合用药的方法所诱导出的主动脉瘤可观测到更多的病理变化，更能模拟临床动脉瘤的演变过程。

2.基因工程模型

基因工程模型是通过转基因或基因敲除等基因修饰技术使动物发生基因突变或缺失，在此基础上单独或联合药物，引起ECM、弹力蛋白、胶原蛋白、主动脉管壁细胞结构或关键酶异常，形成主动脉瘤。由于C57BL/6小鼠已完成全基因组测序，基因操作技术较为成熟，也就成为了目前最常用的转基因实验动物［35］。基因工程模型可以从基因、分子角度来探索主动脉瘤的发病机制，尤其适用于MFS等基因异常引起的主动脉瘤，此外，还有部分基因工程模型可增加动物动脉瘤发生的易感性，并已广泛应用于实验研究。

建立动脉瘤模型常用的基因工程鼠是ApoE-/-小鼠及LDLR-/-小鼠，主要是因ApoE和低密度脂蛋白基因缺失可引起脂代谢异常，引发高脂血症，通过联合使用AngⅡ，使VSMCs受损形成腹主动脉瘤。此模型可出现主动脉粥样硬化、附壁血栓形成等病理特征［22-23］。由于MMP参与了主动脉瘤管壁弹力纤维的降解，因此，Apo与MMP基因双敲除小鼠应运而生。该模型更适用于研究MMP在腹主动脉瘤发病中的作用，且模型成功率与ApoE-/-小鼠相比明显升高，但由于敲除了2个关键基因，小鼠早期死亡风险也相应增加［36］。

针对基因特征明确的特定疾病，研发出了专用的基因工程动物模型，如研究MFS的FBN1基因突变小鼠，MFS是一种累及多器官的结缔组织病，其患者由于FBN1基因突变，使主动脉中层弹力蛋白减少［6］。研究LDS的TGFBR1、TGFB2和TGFBR2基因突变小鼠，在组织学上表现为主动脉壁中膜变性及弹力纤维断裂，这一点与MFS病理学表现相似［6，37］。但是，由于基因突变动物价格昂贵，饲养条件要求较高，使其应用受到了限制。

3.手术模型

手术模型是指通过手术方法直接构建符合疾病特点的动物模型，其不同于药物诱导模型和基因工程模型，手术模型无法呈现动脉瘤的病理特征，因此多用于主动脉瘤的腔内治疗及血流动力学等方面的研究。

3.1.主动脉修补手术模型

常用的主动脉瘤模型手术方法是将主动脉纵形切开后使用补片对切口进行修补，由于所使用补片与主动脉相比结构相对较弱，手术部位在血压作用下扩张形成动脉瘤。常选择肾动脉以下、髂动脉分叉处以上的腹主动脉进行造模，实验所用的移植物或补片通常来自自体静脉、肠管等，也可使用人工补片［38-40］。该实验方法由于所选择的补片及主动脉切口大小受研究者自行控制，因此其最终形成的动脉瘤瘤体大小相对可控，但手术操作时间长、创伤大，且无法表现出动脉粥样硬化、ECM降解、管壁炎症细胞浸润等病理变化，仅用于主动脉瘤的形态学研究。

3.2.脱细胞移植手术模型

1994年Allaire等［41］将豚鼠腹主动脉经十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）脱细胞处理，造成管壁的细胞结构破坏，只保留弹性蛋白和胶原蛋白等ECM成分，经脱细胞处理并移植入Lewis大鼠体内的主动脉作为外源移植物，成了免疫反应的靶器官，在宿主免疫作用下，移植血管表现为ECM破坏和主动脉扩张，术后8周的病理切片可以观察到管壁中层变薄，变薄的管壁在血压的影响下发生重塑，形成动脉瘤。该方法手术难度较大，需要术者具备成熟的血管吻合技术，目前多用于研究VSMCs对腹主动脉瘤的保护作用及平滑肌细胞对MMP的抑制作用。

3.3.人工血管移植及腔内手术模型

目前腹主动脉瘤多采用介入治疗，因此，我国龚万和等人成功建立了犬的主动脉瘤模型，主要方法是使用将两段直径6 mm的人工血管与直径29 mm的人工血管的两端进行吻合，制作成为一段中间部位膨大腹主动脉瘤假体，并将假体与腹主动脉进行吻合，术后5个月解剖见假体部位腹主动脉血流通畅［42］。该模型主要应用于主动脉覆膜支架的设计，但手术操作难度高，需要术者掌握熟练的血管吻合技术，手术时间长，约120 min，随时间的延长，动物下肢缺血、瘫痪的风险也相应增加。

景在平等学者还曾通过腔内手术操作直接损伤血管内膜，在术后2周成功诱导形成胸主动脉夹层动脉瘤［43］。该方法需要特殊的造瘤器械，并且对操作人员有放射性损伤。但该方法成瘤周期短，尤其适用于夹层动脉瘤破裂、介入手术治疗等的研究。

小 结

主动脉瘤模型建模方法较多，而理想的模型应具备成功率高、死亡率低、可重复性强、操作简单、成本低等特点。通过对主动脉瘤动物模型的制作方法、病理表现的研究，我们发现不同方法构建的模型各有特色，但均不能完美地模拟人类主动脉瘤的全部病理生理特征，因此，在研究中我们还需要根据实验要求而选择合适的主动脉瘤模型。