基于TMT标记蛋白质组学技术研究接装纸赋甜对唾液蛋白表达的影响

杨 月，刘梦梦，张 媛，伍鹏霖，董卉林，吴昌健，陈 蕊，朱怀远，曹 毅

江苏中烟工业有限责任公司，南京市建邺区兴隆大街29 号 210019

为满足消费者对烟草制品感官舒适性方面的需求，卷烟工业企业通常采用赋甜的方式增强烟草制品的甜味感，使烟气更加柔和、细腻，从而提高烟草制品的感官品质。其中，在接装纸上施加甜味成分是较为常见的赋甜方式［1］。研究表明，卷烟抽吸过程中口腔感受到的甜味能够增加甜润感和生津感，使烟气柔和细腻，有效降低刺激性，改善卷烟感官质量，从而给消费者带来愉悦感和舒适性［2］。人体唾液是由口腔腺体分泌产生的混合液，具有润滑、辅助消化和抗菌等诸多作用。唾液中包含DNA、RNA和蛋白质信息、代谢产物以及多种微生物，对于口腔疾病、肿瘤以及其他系统疾病的诊断具有巨大的应用价值［3］。由于各种生理病理状态均有相关蛋白的参与，因此对唾液蛋白的功能及其分泌的分子机制研究有利于生理状态和各种疾病的诊断［4］。

近年来，蛋白质组学技术的发展为唾液蛋白质的鉴定奠定了基础。蛋白质组学（Proteomics）是以蛋白质为研究对象，高通量系统化解析蛋白质组成、功能及相互作用的科学。蛋白质是生命活动的承担者，蛋白质组学能够从蛋白水平上揭示研究对象的生理状态、病理状态等过程的作用机制［5］。随着质谱仪器的发展，基于质谱技术的蛋白质组学定量技术得到了广泛应用，目前蛋白质组学技术在烟草领域主要应用于烟草中蛋白质表达差异的分析［6-8］，但是尚未有通过唾液蛋白质组差异评价抽吸卷烟后人体感官感受方面的研究。为此，本研究中采用基于二级谱（MS2）定量的串联质谱标签（Tandem mass tag，TMT）标记的定量蛋白质组学技术对接装纸赋甜卷烟及同规格未赋甜卷烟抽吸前后的差异蛋白进行鉴定，旨在从分子水平客观评价卷烟赋甜技术对人体产生的生理影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

接装纸不含甜味剂的卷烟，同规格（叶组配方、香精香料以及卷烟辅材均一致）接装纸施加甜味剂的卷烟（江苏中烟工业有限责任公司提供）。

尿素（≥98%）、乙二胺四乙酸（≥98.5%）、三氟乙酸（≥99%）、蔗糖（99%）、氯化钾（99%）、碘乙酰胺（≥99%）和氢氧化钠（≥98%）（德国Sigma公司）；十二烷基硫酸钠（95%）、羟甲基氨基甲烷（99%）、二硫苏糖醇（≥97%）、甘氨酸（＞99%）、丙烯酰胺凝胶（30%）和丙烯酰胺凝胶促凝剂（≥99%）（北京索莱宝科技有限公司）；盐酸、丙酮（AR，北京化工厂有限责任公司）；二维蛋白定量试剂盒（美国GE Healthcare公司）；TMT试剂盒（美国Pierce公司）。

Ultimate RSLCnano 3000超高效液相色谱仪（美国 Dionex 公 司）；Sep-Pak C18色 谱 柱（美 国Phenomenex 公司）；Q Exactive HF 四极杆轨道阱质谱仪、Pico21 常温离心机（美国Thermo Scientific 公司）；LC20AD 高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；5430R 冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；1645050 型垂直板电泳仪（美国Bio-rad 公司）；PB-10pH 计、BSA224S-CW 电子天平（感量0.000 1 g）（德国Sartorius 公司）；Biopette 微量移液器（10、100和1 000 μL，美国Labnet公司）；WD-2102A全自动酶标仪（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 唾液样本的采集与处理

（1）唾液样本的采集。分别采集6名35～55岁之间被试者（没有糖尿病、自身免疫性疾病或暴露于放射或化学疗法的病史）［9］在自然状态下不抽烟（对照组，KB）、抽吸赋甜卷烟（赋甜卷烟组，SK-A）后5 min 以及抽吸同规格未赋甜卷烟（未赋甜卷烟组，SK-B）后5 min 的唾液样本2 mL，样品依次标记为KB-1～KB-6、SK-A1～SK-A6、SK-B1～SK-B6。 抽吸赋甜卷烟和未赋甜卷烟时间间隔2 h，期间被试人员保持静息状态，所有唾液样本均在-20 ℃下保存。

（2）唾液蛋白的提取及酶解。向样品中加入裂解液［2.5%十二烷基硫酸钠，0.1 mol/L 羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl，用盐酸调节0.1 mol/L 羟甲基氨基甲烷至溶液pH=8.0），1%蛋白酶抑制剂混合物］充分混合均匀，冰水浴超声10 min，4 ℃条件下14 000 r/min 离心10 min，取上清液。利用丙酮沉淀法沉淀蛋白，向沉淀中加入8 mol/L 尿素溶液（pH=8.0）溶解沉淀，然后加入二硫苏糖醇至终浓度为15 mmol/L，37 ℃孵育1 h。随后加入碘乙酰胺至终浓度为30 mmol/L，室温避光进行烷基化反应。Bradford法对蛋白定量，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。向样品中加入0.1 mol/L Tris-HCl 溶液（pH=8.0），将尿素浓度稀释至2 mol/L以下，按m胰蛋白酶：m蛋白=1∶50加酶，37 ℃孵育过夜。接着加入三氟乙酸终止反应，并将溶液pH 值调至6.0左右，12 000 r/min 离心15 min，取上清液经Sep-Pak C18柱进行脱盐处理，收集滤液并用离心浓缩仪将溶剂完全挥发，干物质在-20 ℃下保存。

1.2.2 TMT标记及LC-MS/MS分析检测

取等量的样品进行TMT 标记（详细步骤参照TMT 生产厂家说明书）。将等量混合标记后的样品于14 000 r/min 条件下离心5 min，将上清液上样至Sep-Pak C18柱上，并利用高pH反相色谱分离法对混合样品进行分级分离，最终合并为15个组分，真空干燥后在-80 ℃下保存。测定前将每个样本溶于0.1%甲酸中，14 000 r/min 离心5 min，将上清液转移至色谱瓶中进行LC-MS/MS 分析。分析条件：

对肽段样品通过自动进样器取样并结合至C18捕获柱，洗脱至分析柱（75 μm × 250 mm，粒径2 μm，孔径100 Å，Acclaim PepMap C18柱）进行分离。利用两个流动相（流动相A：0.1%甲酸；流动相B：0.1%甲酸+80%乙腈）建立100 min 的分析梯度（5%B 0 min，5% ～23%B 65 min，23% ～52%B 20 min，52% ～80%B 1 min，80%B 4 min，80% ～5%B 0.1 min，5%B 9.9 min），液相流速为300 μL/min。数据依赖型串联质谱（DDA，Data dependent acquisition）模式分析时，每个扫描循环中包含一个MS全扫描（R=60 K，AGC=106，max IT=50 ms，质量扫描范围350 ～1 800 amu），以及随后的 20 个 MS/MS 扫描（R=30 K，AGC =5×104，max IT=200 ms）。碰撞能量设置为26 eV。四极杆的筛选窗口设置为1.2 Da。离子重复采集的动态排除时间设置为40 s。

1.2.3 生物信息学分析

以人的蛋白质组（Homo_sapiens_9606_UP_20210128.fasta）作为参考数据库对质谱数据进行检索，以蛋白和肽段水平1% 伪发现率（FDR，False discovery rate）为标准进行筛选。根据差异倍数＞1.2 或＜0.83 筛选差异蛋白，并进行T 检验（P＜0.05），得到组间显著差异的蛋白质。利用Gene Ontology（GO）数据库（www.geneontology.org）对鉴定到的蛋白质进行功能注释和富集分析，GO 分为分子功能、细胞组分和生物过程［10］。利用真核生物亚细胞定位软件WoLF PSORT 对差异蛋白进行亚细胞定位预测。利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库（www.genome.jp/kegg/）确定差异蛋白参与的代谢通路［11］。

2 结果与分析

2.1 差异蛋白的鉴定

自然状态下未抽吸对照组、抽吸赋甜卷烟以及抽吸同规格未赋甜卷烟3 个组的唾液，每组6 个样本，共计18个样本。通过数据库检索对蛋白质进行鉴定，从表1可见，共获得764 583个二级谱图，鉴定肽段匹配得到的谱图共29 481个，总肽段数有8 440个，特异肽段数有1 033个，蛋白质总数2 099个。从KB、SK-A和SK-B组中均鉴定到了2 042个蛋白质组分。

表1 唾液样品蛋白质鉴定结果Tab.1 Protein identification results from saliva samples

根据差异倍数＞1.2 或＜0.83 且 P＜0.05 为标准筛选差异蛋白（显著上调表达蛋白和显著下调表达蛋白）。如图1a所示，与自然状态下对照组唾液中的蛋白相比，赋甜卷烟组中鉴定到的差异蛋白数为5个，其中，上调表达蛋白4个，下调表达蛋白1个；与对照组相比，未赋甜卷烟组中鉴定到的差异蛋白数为107个，其中，上调表达蛋白102 个，下调表达蛋白5 个。可见，赋甜卷烟组唾液中鉴定到的差异蛋白数量明显减少。同时对鉴定到的差异蛋白进行比较，得到1个在两组中同时上调表达的蛋白，1个共同下调表达的蛋白以及在各组中特异表达的蛋白。另外，分析未赋甜卷烟组与赋甜卷烟组差异蛋白，共鉴定到59个，其中，上调表达蛋白55个，下调表达蛋白4个（图1b），说明赋甜卷烟组和未赋甜卷烟组唾液蛋白存在较大差异。以上结果表明口腔受到未赋甜卷烟烟气的刺激后，引起较多蛋白的快速表达以响应口腔环境的变化；而抽吸赋甜卷烟后，甜味的摄入减弱了人体对烟气的刺激性感受，从而唾液中蛋白质组的变化较小，人体的感官感受更加舒适。

图1 未赋甜卷烟组和赋甜卷烟组唾液差异蛋白比较Fig.1 Differential proteins in saliva samples between groups smoking cigarettes with unsweetened tipping paper and sweetened tipping paper

2.2 差异蛋白的富集分析

2.2.1 GO 富集分析以及亚细胞定位预测

将赋甜卷烟组和未赋甜卷烟组中鉴定的差异蛋白进行GO 富集分析，主要包括生物过程、分子功能和细胞组分方面。SK-B vs SK-A 中59 个差异蛋白的GO 富集分析结果（图2）显示，在细胞组分方面这些差异蛋白主要位于内膜系统、膜封闭腔、细胞器腔、非膜界细胞器以及胞外域等组分中。在分子功能方面主要与酸类物质、离子等的结合相关，分为金属离子结合、DNA 结合、锌离子结合、羧酸结合、有机酸结合以及微管结合等方面。在生物学过程方面主要与免疫、物质运输以及响应外界刺激相关，分为免疫系统过程、免疫响应、正调节细胞过程、囊泡介导的运输、细胞对化学刺激的响应以及细胞分泌等方面。赋甜卷烟组和未赋甜卷烟组中鉴定的差异蛋白在生物过程、分子功能和细胞组分方面均存在较大的差异，表明在接装纸上施加甜味剂能够显著改善人体抽吸卷烟时唾液中应激蛋白的表达及组成。

图2 未赋甜卷烟组和赋甜卷烟组差异蛋白的GO富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of differential proteins in groups smoking cigarettes with unsweetened tipping paper and sweetened tipping paper

亚细胞定位预测结果显示，未赋甜卷烟组与赋甜卷烟组中59 个差异蛋白主要定位于细胞质（48%）、胞外（19%）、线粒体（18%）、核（13%）以及细胞骨架（3%）部位（图3）。

图3 未赋甜卷烟组和赋甜卷烟组差异蛋白的亚细胞定位预测结果Fig.3 Predicted subcellular localizations of differential proteins in groups smoking cigarettes with unsweetened tipping paper and sweetened tipping paper

2.2.2 KEGG 富集分析

分别将赋甜卷烟组和未赋甜卷烟组鉴定的59个差异蛋白进行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因和基因组数据库）代谢通路分析。如图4 所示，这些差异蛋白主要参与代谢途径、次生代谢物的生物合成、不同环境下的微生物代谢、药物代谢其他酶、松弛素信号通路、嘌呤代谢以及趋化因子信号通路等代谢通路。KEGG代谢通路分析结果表明，未赋甜卷烟组与赋甜卷烟组唾液中鉴定的差异蛋白参与到不同代谢通路中。

图4 未赋甜卷烟组和赋甜卷烟组差异蛋白的KEGG 通路分析Fig.4 KEGG pathway analysis of differential proteins in groups smoking cigarettes with unsweetened tipping paper and sweetened tipping paper

3 讨论

利用蛋白质组学技术鉴定赋甜卷烟组唾液和未赋甜卷烟组唾液中的差异表达蛋白，有助于从分子生物学的角度解析接装纸赋甜技术对消费者抽吸卷烟后感官的影响。本研究中通过对抽吸赋甜卷烟唾液和抽吸同规格未赋甜卷烟唾液中的差异蛋白进行鉴定和分析，结合GO 富集分析和功能注释，进一步解析赋甜卷烟对人体的影响。从生物学过程的角度，在抽吸未赋甜卷烟和赋甜卷烟消费者唾液中共鉴定到与刺激响应相关的差异蛋白9个，差异蛋白的详细信息如表2所示。这些蛋白所表现的刺激响应类别主要有刺激响应、非生物刺激响应、外部刺激响应、细胞刺激响应和对外部刺激响应的调节等。这些刺激响应蛋白在未赋甜卷烟组唾液中显著上调表达，在赋甜卷烟组唾液中表达量显著降低，表明在接装纸上施加甜味剂能够显著减少抽吸卷烟时烟气对口腔的刺激。这种生物功能上的刺激既包括卷烟感官评价方法中的烟气刺激性，也包括烟气对人体产生的轻松感、满足感以及舒适感。研究表明，甜味感知取决于舌头上的两个G 蛋白偶联亚基受体T1R2和T1R3［12-13］，人通过摄入富含甜味剂的饮食刺激这些受体，就会产生愉悦感［14-15］。同理，消费者在抽吸接装纸赋甜卷烟时，口腔可直接感受甜味剂带来的甜感，弱化因烟气刺激、干燥以及收敛所带来的口腔不适，从而感觉更加愉悦和舒适。这种分子生物学上的差异也从客观上佐证了卷烟接装纸赋甜有利于提升卷烟的感官品质。

从分子功能的角度分析，与抽吸赋甜卷烟相比，抽吸未赋甜卷烟组唾液中的3 个上调表达蛋白（O00602、P05109和P06702）表现出与有机酸结合的特性（图2），其中，P05109和P06702与刺激响应相关（表2）。有机酸与卷烟吸味品质密切相关，烟气中的有机酸一方面能够产生酸香香韵，另一方面与卷烟烟气的口感特征如收敛感和干燥感密切相关［16］。在乳清蛋白饮料中，pH过低会引起口腔明显的收敛感［17］，这种收敛感的产生主要是酸性物质与唾液蛋白形成不溶沉淀物，导致口腔润滑性降低［18］。未赋甜卷烟组和赋甜卷烟组差异蛋白与有机酸结合的同时也能响应刺激，表明烟气中的有机酸可能会导致口腔的收敛感和刺激感增强，而这2个差异蛋白在未赋甜卷烟组唾液中显著上调表达，在赋甜卷烟组唾液中表达显著降低，表明接装纸上施加的甜味剂能够明显减少由有机酸引起的口腔刺激。

从KEGG 通路角度，抽吸未赋甜卷烟组唾液中的 5 个 上 调 表 达 蛋 白（P06733、A0A024R7R1、A0A140VK56、B4DFP1 和 V9HVZ4）参与不同环境下的微生物代谢通路（表2，表3）。而赋甜卷烟因在接装纸中施加了甜味剂，也有可能影响口腔微生物的代谢。目前已有研究报道烟气对口腔微生物环境的影响［19-20］，但对于接装纸中甜味剂的施加是否能够改善微生物种群结构有待进一步研究。

表3 不同环境下的微生物代谢通路相关差异蛋白的鉴定和分析Tab.3 Identification and analysis of differential proteins in the pathway of microbial metabolism in diverse environments

赋甜卷烟组和未赋甜卷烟组的差异蛋白中，A8MX94 属于谷胱甘肽巯基转移酶（GSTP1），定位于细胞质，具有谷胱甘肽转移酶活性，参与谷胱甘肽代谢过程（表4）。有报道表明，在急性社会心理压力后口腔唾液中的谷胱甘肽巯基转移酶表达明显升高［21-22］，GSTP1在未赋甜卷烟组唾液表达显著升高，在赋甜卷烟组表达降低，说明抽吸赋甜接装纸卷烟在舒缓情绪、减少心理压力方面效果显著。另外，在这些差异蛋白中，P05109、P06702 和 P80511 分别是S100-A8、S100-A9 和 S100-A12 蛋白（表 2），属于S100家族的Ca2+结合蛋白，在调节炎症和免疫反应中起重要作用［23］，有越来越多的研究［24-26］表明社会心理因素会影响S100 蛋白的水平。一项临床前小鼠模型的研究发现，肾上腺素、去甲肾上腺素、皮质醇和血清素等应激激素可诱导 S100-A8 和S100-A9 的快速释放［24］；另一项研究发现乳腺癌患者的焦虑、抑郁和社会幸福感得分与唾液S100-A8和S100-A9水平显著负相关［25］。未赋甜卷烟组唾液S100-A8、S100-A9 和 S100-A12 的表达水平显著高于赋甜卷烟组，同样也说明卷烟接装纸中甜味剂的释放对吸烟者的情绪能够起到较好的舒缓作用，使之处于一种轻松的状态，从而有效提升吸烟者的愉悦感。

表2 与未赋甜卷烟组和赋甜卷烟组刺激响应相关的差异蛋白Tab.2 Differential proteins associated with stimulus response in groups smoking cigarettes with unsweetened tipping paper and sweetened tipping paper

表4 未赋甜卷烟组和赋甜卷烟组差异蛋白A8MX94 的鉴定和分析Tab.4 Identification and analysis of differential protein A8MX94 in groups smoking cigarettes with unsweetened tipping paper and sweetened tipping paper

4 结论

①通过TMT标记的定量蛋白质组学技术，在未赋甜卷烟组和赋甜卷烟组中鉴定的差异蛋白多达59个，在GO条目中刺激响应相关的生物过程以及与有机酸结合的分子功能等显著富集；②在抽吸未赋甜卷烟过程中，烟气中有机酸类等物质对口腔产生刺激，引起与有机酸结合相关蛋白的显著上调表达，表明其对口腔的刺激较为明显；③在抽吸接装纸赋甜卷烟时，口腔可直接感受甜味剂带来的甜感，弱化因烟气刺激、干燥以及收敛所带来的口腔不适，因此该组唾液中差异蛋白的数量显著减少，刺激响应相关蛋白的表达水平显著降低，从而感觉更加愉悦和舒适，从分子生物学角度客观反映了接装纸赋甜技术有利于提升卷烟感官品质。