光纤集成化高分辨率无标记差分显微成像系统

罗 昊，侯梦蝶，徐 良,2，杨臻垚，匡翠方,2*，曾祥龙*，朱大钊*

1之江实验室智能芯片与器件研究中心，浙江 杭州 310023；

2极端光学技术与仪器全国重点实验室，浙江 杭州 310027；

3上海大学特种光纤与光接入网重点实验室，上海 200444

1 引言

由于光的衍射效应，在过去的很长一段时间里，科学界一致认为传统光学显微成像系统的最小分辨能力存在极限，显微系统能分辨出的最小细节信息大约在照明光波长的一半量级。直到上世纪90 年代，许多科学家提出了多种新型的显微成像方案来突破衍射极限。包括已被广泛应用的受激辐射损耗显微镜(stimulated emission depletion microscopy,STED)[1-4]、随机光学重建显微术 (stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)[5-6]、光激活定位显微术(photoactivated localization microscopy,PALM)[6-8]、结构光照明显微术(structured illumination microscopy,SIM)[9-10]、荧光发射差分显微术(fluorescence emission difference microscopy,FED)[11]、光片荧光显微术(light sheet fluorescence microscopy,LSFM)[12]等。但这些方法大多基于荧光发射机制，也就是需要样品自身在激发光照射下发出另一波长的携带样品信息的光信号。在生命科学领域和医学研究领域中，研究对象往往是细胞、组织等，可以通过荧光蛋白标记被测样品来使样品具备荧光特性，以满足上述超分辨成像方法的需求。但对于非生命样品、无法进行荧光蛋白标记的样品而言，上述方法便很难发挥作用。然而近年来对于无标记样品的超分辨显微成像技术的发展相对缓慢。

目前在观测无法标记的样品时，较为成熟的方法是近场扫描光学显微 (scanning near-field optical microscopy,SNOM)技术。此外，基于纳米结构的光调制方案也可以实现无标记样品的超分辨成像，包括超透镜成像[13]、微球成像[14]、基于超材料的显微成像[15]等，这些技术在某些应用场景可以提供媲美荧光标记超分辨技术的高分辨率。但遗憾的是，这些技术大部分只能作用于样品表面，成像深度有限。再者，这些方法往往对器件的制造精度具有很高要求，技术手段相对复杂，综合实现成本较高。为此，发展新的无标记高分辨成像技术仍然是目前科学界的重要任务。

荧光发射差分(FED)显微技术最早应用于荧光样品，采用相同波长的实心光斑和空心光斑分别对样品进行成像，后经数据处理将所得的两幅图像整合成一张具有超分辨细节信息的图像。由于FED 技术无需对特定的荧光标记进行激发和抑制，实际上可以推广应用于无标记的超分辨成像系统。在传统方法中，空心光斑和实心光斑的生成与调控是基于空间光调制器或涡旋相位板以及多组空间光学器件实现的，导致系统光路复杂，调节难度大，且运行过程中易受外部干扰而影响最终成像质量。

近年来，多种通过光纤器件生成环形光束的方案被相继提出。得益于光纤中的高阶模式均具有圆对称性，尤其是近年来被广泛研究的光纤LP11标量模式，其在单独x方向或y方向的模场分布形式为被一条暗线分为两半的圆，若两种分量的比例相同，则合光场分布正好为一个圆环形式。光纤标量模中的LP11模式又对应四种矢量模式：TE01，TM01，以及HE21的两种简并模式，这些矢量模式均具有单环形的光场强度分布形式，且具有中心对称的偏振态分布形式，也被称作柱矢量光(cylindrical vector beam,CVB)[16-21]。并且上述四种矢量模式中相互正交的两种模式组合后即可得到具有螺旋状相位波前的涡旋光(optical vortex beam,OVB)。例如Zou 等人提出的全光纤激光器[22]，通过将少模光纤和Pr3+/Yb3+掺杂的ZrF4-BaF2-LaF3-ALF3-NaF (ZBLAN)光纤的纤芯错位对接，从而激发出特定的光纤模式，可直接输出波长为635 nm 的涡旋光。Zhang 等提出了一种采用声致光纤光栅的方案在少模光纤中产生532 nm 波长的高阶模式的方案[23]。Yan 等设计了特殊的多层结构光纤，通过在这种光纤上写入长周期光纤光栅(long period fiber gratting,LPFG)，可以将输入其中的基模光场转化为环形光输出[24]。

本文提出了一种基于光纤模式选择耦合器(mode select coupler,MSC)的差分成像方法(MSC-FED)。首先基于光纤模式耦合机制设计制备了一种光纤模式选择耦合器(MSC)，优于上述其它形式的模式选择方案，该MSC 实现了94%的模式转化效率和98%的输出模式纯度。该耦合器有两个输入端口，通过其中一端口输入的普通高斯光将转化为环形光场分布的涡旋光输出，通过另一端口输入的普通高斯光将保持以高斯型光场分布的光纤基模形式输出。并且由于上述两种输出光束均通过光纤器件的同一端口出射，直接实现了两种光束在后续光路中始终保持精确的中心重合。利用该器件解决了光斑形态、严格对准的调控问题，并实现了基于FED 原理的无标记显微成像。本方法充分发挥FED 成像直接应用于高分辨率无标记图像的技术优势，更极大地增加了系统的集成度，降低了系统成本。

2 基本原理

2.1 光纤MSC 器件的基本原理

通过光纤MSC 器件选择性输出实心光斑和空心光斑，充分利用了光纤中的前两阶标量模式：光纤中的基模LP01模式的光场横截面为高斯型分布，在大NA 透镜聚焦下可得优质的圆形光斑；光纤中的LP11模式在两正交偏振分量比例相等的情况下，其光场横截面为单环形分布，当满足一定条件时，该光场可转化为具有螺旋状相位波前的涡旋光(OVB)，在大NA透镜聚焦下可得具有明显暗心的环形光斑。

根据光纤模式耦合理论，当两根光纤的纤芯足够接近时，如果两光纤中存在等效折射率相近的两种传输模式，则在其中一根光纤中以特定模式传输的光功率会向另一根光纤中的对应模式耦合，并且这种功率耦合是可逆的，会在耦合区域内沿传播方向周期性地发生。结合本系统的实际需求，选取一根对于532 nm 波长的少模光纤(FMF)与一根对于532 nm 波长的单模光纤(SMF)并行熔融拉锥制成光纤MSC。如图1(a)所示，通过精确控制耦合区的相关参数，使得输入到单模光纤的532 nm 连续激光极大程度地耦合到少模光纤的LP11模式中并通过少模光纤输出。以光纤基模形式输入到少模光纤的532 nm 连续激光，由于不满足模式耦合条件，最终仍以基模形式通过该少模光纤输出，如图1(b)所示。在耦合区内，两根光纤的包层熔融在一起，纤芯形成双锥型结构。为了避免外界扰动对模式耦合效率的影响，MSC 的熔融拉锥区域被封装在U 型玻璃基底上，然后通过热缩管密封。

图1 光纤模式选择耦合器原理图。当基模形式激光分别从(a)单模光纤，以及(b)少模光纤输入端输入MSC 时，单模光纤输出端与少模光纤输出端分别输出的光场分布形式Fig.1 Schematic diagram of the fiber mode selection coupler.Output of the single-mode fiber and the few-mode fiber,when the fundamental mode laser is separately launched into (a) the single-mode fiber,and (b) the few-mode fiber

制备MSC 的两种光纤在未拉锥前的主要参数如下：单模光纤的纤芯直径为6.2 μm，包层直径为125 μm，纤芯折射率为1.4678，包层折射率为1.4615；少模光纤的纤芯直径为14 μm，包层直径为125 μm，纤芯折射率为1.467，包层折射率为1.4615。

为使通过单模光纤输入的LP01模式的532 nm 连续激光最大程度地耦合到少模光纤的LP11模式中，需保证MSC 耦合区域内两种相应模式的等效折射率相同。由于拉锥过程不改变纤芯和包层的折射率，只是等比例缩小纤芯和包层直径，又因为实际采用的单模和少模光纤的包层直径相对纤芯直径来说足够大，所以影响拉锥后光纤内本征模式等效折射率的主要参数只有拉锥后的纤芯直径。图2 给出了拉锥后单模光纤中LP01模式(图中黑色曲线)，以及少模光纤中LP11模式(图中红色曲线)的等效折射率对应拉锥后纤芯直径大小的关系。

图2 对于532 nm 工作波长，单模光纤中LP01 模式和少模光纤中LP11 模式的等效折射率与纤芯直径的对应关系Fig.2 Mode effective index curves for the LP01 mode in SMF and the LP11 mode in FMF as functions of core radius,at the wavelength of 532 nm

另一方面，当少模光纤的纤芯直径为4 μm 时，该光纤恰好仅支持前两阶标量模式(LP01模式和LP11模式)的传输。所以在实际制备MSC 的过程中，将耦合区域内少模光纤的直径控制在4 μm 左右，可有效避免输入光功率耦合至三阶以上标量模式中导致输出的环形光质量下降。

通过图2 可知，当少模光纤的纤芯直径为4 μm时，其中支持的LP11模式的等效折射率约为1.463，在图中找到单模光纤中LP01模式同样具有等效折射率1.463 的点，对应的纤芯直径约为1.8 μm。所以实际制备MSC 时将耦合区域内少模光纤的纤芯直径控制在4 μm，并将耦合区域内单模光纤的纤芯直径控制在1.8 μm。

制备MSC 时首先将少模光纤和单模光纤进行预拉锥，令单模光纤与少模光纤的纤芯直径比例为0.45。然后将预拉锥后的单模光纤与少模光纤并排放置，并再次进行熔融拉锥。由于熔融拉锥的过程中，两光纤纤芯的直径会等比例缩小，当少模光纤的纤芯直径缩小为4 μm 时，单模光纤的纤芯直径会自然缩小为1.8 μm。

根据光纤耦合模式理论，在耦合区域内，单模光纤与少模光纤中场强的变化规律如下：

其中：A1(z)、A2(z)分别为单模光纤中光纤基模的强度与少模光纤中LP11模式的振幅，二者是耦合区域传输距离z的函数，β1和 β2分别为上述两种模式的等效传输常数，C11和C12是自耦合系数，C12和C21是互耦合系数。通常自耦合系数相对互耦合系数很小，可忽略，且两互耦合系数近似相等，即C12=C21=C。互耦合系数是与耦合区域尺寸和长度相关的参数。

由式(1)～(2)可得激光从单模光纤输入端输入MSC 时，两输出端口的光功率与耦合区长度的关系：

带入本文中应用MSC 的实际参数，可得激光以基模形式输入单模光纤输入端时，光场在MSC 的耦合区域中周期性转化的规律，如图3 所示(Rsoft 软件仿真结果)。由图可知，在耦合区内，单模光纤中的基模功率与少模光纤中LP11模式的功率以大约800 μm的传输距离为半周期相互耦合转化。当耦合区长度满足匹配条件时，两模式间的互耦合系数最高可达98%。

图3 在MSC 的耦合区域中，单模光纤中的LP01 模式和少模光纤中的LP11 模式周期性转化规律的仿真图Fig.3 Simulation of periodic transformation between the LP01 mode in the single-mode fiber and the LP11 mode in the few-mode fiber,in the coupling region of MSC

理论上，当MSC 耦合区的长度刚好为奇数个完整耦合周期的一半时，输入SMF 的激光功率将被最大程度地耦合到FMF 的LP11模式中。仿真结果表明，当耦合区域的长度和纤芯直径满足匹配条件时，以LP01模式输入SMF 的工作波长532 nm 的光功率几乎可以完全耦合到FMF 的LP11模式中，如图4 所示。

图4 在满足匹配条件的情况下，宽谱激光从MSC 的单模光纤输入端注入时，从单模光纤输出端(黑色曲线)和少模光纤输出端(红色曲线)输出的光谱图。在工作波长532 nm下，绝大部分功率从少模光纤端输出Fig.4 Spectrum diagram of the output of the single-mode fiber(black curve) and the output of the low-mode fiber (red curve) when the wide-spectrum laser is injected from the single-mode fiber input of the MSC under the matching conditions.At the working wavelength of 532 nm,most of the power output is from the few-mode fiber end

另一方面，由于少模光纤中的基模光场并不满足与单模光纤中任意模式的耦合匹配条件，所以以LP01模式输入FMF 的光功率可保持80%以上的效率仍以LP01模式在FMF 中传输。制备过程中，在拉锥的同时保持将532 nm 波长的连续光输入SMF，并实时监测FMF 输出的光场分布形式和功率。经过多次实验将拉锥的温度、速度、时间等参数迭代优化，最终得到模式耦合效率最高的MSC。实测本实验中采用的MSC，当激光从单模光纤注入，并以LP11模式从少模光纤输出时，传输损耗约为1 dB，端口间串扰约为0.008 dB。

2.2 MSC-FED 成像系统原理

采用光纤器件替代传统空间光传输和调控，极大地增加了系统的集成度。系统的基本原理如图5 所示。由半导体激光器发出的波长为532 nm 的连续激光首先经过一个1×2 耦合器被分为两路，然后分别经过一个集成在光纤光路中的声光调制器(AOM)，以实现上升沿/下降沿时间均小于10 ns 的高速开关控制。经过AOM 后的两路光分别入射上文所述光纤MSC 的单模光纤输入端和少模光纤输入端。通过对AOM 的开关控制，两路光分时从光纤MSC 的少模光纤输出端交替输出。在光纤MSC 的少模光纤输出端还加入了光纤偏振态控制器(FPC)对输出光场做进一步调制，使通过MSC 单模光纤输入端输入的激光激发出的LP11模式中原本比例随机的四种矢量模重新分配，最终获得涡旋光形式的光场输出。在系统初始调节时，首先在光纤MSC 的输出端准直镜后放置一台CCD 相机，将MSC 少模光纤输入端的光纤AOM 开关关闭，并将单模光纤输入端的光纤AOM 开关打开。此时MSC 输出光场为LP11模式，该模式由两种偏振方向正交的兼并模式组成，本系统要求两种正交偏振的模式分量比例相等，从而使合光场为完美的环形分布。通过调节置于光纤MSC 输出端附近的FPC 对光纤尾端做微量的旋转和挤压，可以连续地调节输出光场中两种正交偏正分量的占比。通过CCD 相机观测可见光场从“分为上下两个半圆”到“一个完整的圆环”到“分为左右两个半圆”的连续变化过程。当调节FPC并观察到一个接近完美的圆环形光场分布时，锁定FPC，并将整个光纤光路用挡板遮罩避免外界干扰。实验结果表明，通过上述方法调节后，在系统连续运行中，光纤MSC 输出的环形光场分布可保持6 小时以上稳定不变。

图5 基于光纤MSC 的FED 成像系统原理图Fig.5 Schematic diagram of the FED imaging system based on the fiber MSC

从光纤MSC 输出的光场可视为一个通过小孔的点光源，发散的光场经透镜准直后首先经过一个半反半透镜，反射光再经过一组二维扫描振镜反射，之后依次经过扫描镜、场镜和显微物镜后聚焦在样品面上。当扫描光斑扫描到样品时，部分被样品散射的光信号反向经过物镜、场镜、扫瞄镜、二维扫描振镜后经过半反半透镜，透射光最终被一根多模光纤收集并传输到PMT 进行信号处理。

FED 系统成像时需进行两次扫描：第一次关闭连接MSC 单模光纤输入端的AOM2，打开连接MSC少模光纤输入端的AOM1，此时MSC 输出为光纤基模形式光场，在样品面上的聚焦光斑为圆形的实心光斑。通过二维扫描振镜的运动，使实心光斑扫描一个区域并得到一幅图像Ic；第二次关闭连接MSC 少模光纤输入端的AOM1，打开连接MSC 单模纤输入端的AOM2，此时MSC 输出为涡旋光形式光场，在样品面上的聚焦光斑为环形的空心光斑。通过二维扫描振镜的运动，使空心光斑扫描同一个区域并得到一幅图像In。通过两次扫描图片加权相减，即可得到更多的样品细节信息，可通过式(5)描述：

式中：IFED为数据整合后的图像，r为加权系数，该值通过实际扫描时实心光斑和空心光斑的具体参数确定。

首先通过MSC 中少模光纤输出端的实际光纤参数：纤芯直径为14 μm，包层直径为125 μm，纤芯折射率为1.467，包层折射率为1.4615。通过仿真软件解得其中LP01模式和LP11模式的模场分布，如图6所示(Comsol 软件仿真结果)。

图6 光纤MSC 中少模光纤输出端支持的前两阶本征标量模式的光场分布图。(a) LP01 模式；(b) LP11 模式Fig.6 Optical field distribution of the first two order eigenmodes supported by the LFM output end of MSC.(a) LP01 mode;(b) LP11 mode

由于从MSC 输出的两种模式光场经由后续透镜组进行等比例缩放，所以在选择式(5)中的加权值r时，可直接通过少模光纤输出端口处两种模式光场分布来近似实际扫描光斑的光场分布进行分析。

为了更直观地展示式(5)中加权系数r对由实心光斑和空心光斑合成的等效扫描光斑的影响，我们将功率归一化后的实心光斑、空心光斑以及二者加权相减后所得的等效扫描光斑制成三维光场分布图。如图7 所示，实心光斑减去0.5 倍、0.7 倍和1 倍的空心光斑后，分别得到相应的等效扫描光斑。这三种光斑沿直径的光场分布曲线分别如图7(a-c)所示，其中紫色虚线代表实心光斑的光场分布、蓝色虚线代表加权后的空心光斑的光场分布、红色实线代表二者相减所得等效光斑的光场分布。

图7 基于光纤MSC 的FED 成像系统中不同加权系数下，在MSC 输出口获得的实心光斑(紫色虚线)、空心斑光场(蓝色虚线)、等效合成光斑光场(红色实线)分布图。(a) r=0.5；(b) r=0.7；(c) r=1Fig.7 Optical field distribution of solid spot (purple dashed line),hollow spot (blue dashed line),and equivalent spot (red solid line) in the FED imaging system based on the fiber MSC with different weighting coefficients,obtained at the output end of MSC.(a) r=0.5；(b) r=0.7；(c) r=1

在少模光纤输出端口处，归一化LP01模场的半高全宽为9.7 μm。分别减去0.5 倍、0.7 倍和1 倍的归一化LP11模场后，所得的等效光场的半高全宽分别为5.5 μm、4.3 μm、3.2 μm。可见随着式(5)中加权系数r的增大，所得等效光场的半高全宽会逐渐缩小。但是这并不意味着FED 系统的分布率可以无限优化，如图7(c)所示，当r=1 时，虽然等效光斑的半高全宽已经小于原实心光斑的三分之一，但是等效光斑的周边区域已经被减为负值，由于扫描共聚焦式显微镜的成像过程相当于扫描光斑与样品图像的卷积，等效扫描光斑中负值的存在会导致最终成像结果中有用信息的缺失。

为获得最佳的成像质量，需要在等效光斑的半高全宽尽可能小的情况下保证其中不会出现复制的影响。在理想的理论计算结果中，本系统的最优加权系数r为0.7，此时等效扫描光斑的半高全宽约为原实心光斑的0.44 倍。在实际系统中，由于光纤输出的模场分布形式不可能与理论计算完全一致，且透镜组的缩放过程会引入某些相差的影响，所以需要在理论最优加权系数r=0.7 的基础上进行小幅调整，通过对金颗粒样品的扫描成像结果进行多组不同加权系数的数据处理，最终确定实际最优的加权系数。

3 实验结果

首先采用金颗粒扫描成像的结果，如图8 所示。样品中金颗粒直径在150 nm 至600 nm 不等，图8(a)是FED 系统采用实心光斑进行第一次扫描取得的结果。图8(b)是FED 系统采用空心光斑进行第二次扫描取得的结果。由于扫描成像结果相当于扫描光斑的强度分布与实际样品图像的卷积，而金颗粒的尺寸很小，可近似于单脉冲信号，所以图中对金颗粒的成像结果能够反映出扫描光斑的光强分布特性，第一次扫描结果中每个金颗粒所在位置呈现为一个实心圆斑，第二次扫描结果中每个金颗粒所在位置呈现为一个空心环形斑。图8(c)是将两次扫描数据进行加权相减后最终生成的图像。通过对比可见，经过FED 处理的图像中，金颗粒的成像尺寸明显减小，一些位置临近的金颗粒在经过FED 处理的图像中更容易被独立分辨出来，如图8(a1)和图8(c1)的放大区域：图中左下角的两颗临近的金颗粒在仅用实心光斑扫描的图像中已经交叠在一起，而经过FED 处理后则可清晰分辨出两颗独立的金颗粒；右上角两颗临近的金颗粒中左侧的一颗在仅用实心光斑扫描时成像的直径约为1.17 μm，而经过FED 处理后成像的直径约为560 nm，证明FED 系统扫描成像的分辨率较传统扫描共聚焦显微镜的分辨率提升到2 倍以上。另外，采用普通扫描共聚焦显微镜进行成像时，常会因背景中一些杂质的散射光影响对实际样品的观测，如图8(a2)所示的放大区域，此时由于杂质对于环形光的散射要比对实心光的散射效果弱得多，所以在图8(b2)中的对应区域仍能清晰地从背景噪声中分辨出金颗粒成像的环形光斑。在经过FED 数据处理后，图8(c2)中的该区域内，在比较明显的背景噪声中，样品的信息被从背景中提取出来，可见，本文所提出的方法可以在较大背景中对样品信息进行提取，相对于传统共聚焦显微镜，极大地提升了系统的成像质量。

图8 应用基于光纤MSC 的FED 系统对金颗粒的扫描成像结果。(a)通过实心光斑扫描；(b)通过环形光斑扫描；(c)将图(a)和图(b)进行加权相减后获得的金颗粒样品像。图(a1-c1)、(a2-c2)分别为图(a-c)中两个局部的放大图Fig.8 Imaging result of gold particles using the FED system based on the fiber MSC.(a)Solid spot scanning;(b) Donut-shaped spot scanning;(c) Image of gold particle samples obtained by weighted subtraction of Figs.(a,b).Figures (a1-c1) and (a2-c2) are enlarged views of two different areas in Figs.(a-c),respectively

在实际工作中，光纤MSC 输出的LP11模式纯度会对最终成像结果产生较大影响。首先，如果输出的LP11模式光场中混杂有一部分基模LP01模式光场，将导致最终输出的环形扫描光斑中暗芯部分的消光比无法达到0。这样在经过FED 系统加权相减的数据处理过程后，相当于位于扫描光斑中心部分的有用信息被削弱，甚至在合成图像中丢失某些样品细节信息。其次，如果输出的LP11模式光场中两正交偏振方向的分量不完全相等，会导致环形扫描光斑的实际光场分布并不是完美的圆环形态。这样在经过FED 系统数据处理后，相当于等效的扫描光斑不再是完美的圆斑，而更接近椭圆斑，会使合成的成像结果在细节上产生一定的畸变。如图8(c1)中，金颗粒样品的最终成像结果在竖直方向上均有略微的拉长，即为环形扫描光斑模式纯度不足带来的影响。

图9 为应用MSC-FED 系统对纳米级的无荧光标记聚合物线对矩阵结构进行扫描成像的结果。该结构由一系列线对组成，其中每根线段的长度约为3 μm，宽度约为150 nm，每对线对的间距由50 nm 到250 nm 不等。这些线对排成4 列，每列由11 对线对组成。图9(a)是FED 系统采用实心光斑进行第一次扫描取得的结果，在该图像中下半部分的线对能够被清晰分辨，而上半部分尤其是第1 列与第2 列的最上面3 组线对的细节信息比较模糊，甚至无法区分开线对中的两根线段。而在图9(b)，即FED 系统采用空心光斑进行第二次扫描取得的结果中，则刚好携带有这些细节信息。在经过FED 数据处理后得到的图像中可以观察到很多结构细节信息，整个线对矩阵中的每对线对均可被清晰分辨开，并且图像中的背景噪声得到了很好的抑制，使线对矩阵结构在图像中凸显出来，如图9(c)所示。

图9 应用基于光纤MSC 的FED 系统对纳米级线对的扫描成像结果。(a)通过实心光斑扫描；(b)通过环形光斑扫描；(c)通过将图(a)和图(b)进行加权相减后获得的纳米线对样品像。图(a1-c1)，分别为图(a-c)中局部的放大图Fig.9 Imaging result of nano-scale wire pairs using the FED system based on fiber MSC.(a) Solid spot scanning;(b) Donut-shaped spot scanning;(c) Image of nano-scale wire pairs obtained by weighted subtraction of Figs.(a,b)

4 结论

本文详细介绍了一种能够产生空心光斑的光纤MSC 器件，该器件利用光纤的模式特征，实现了基于波导的空心光束调控。通过该光纤MSC 器件的两个不同输入端输入光，将会分别以光纤LP01模式和LP11模式从MSC 的同一输出端输出，实现了空心光束和传统实心高斯光束的绝对同心。进一步地，应用该MSC 器件搭建了一套用于无标记样品的MSCFED 成像系统。相对于传统FED 系统采用可编程液晶器件或固定相位板产生空心光斑的方法，本方法无需昂贵的器件，极大地节约了成本。无需空间光传输系统中的合束调校，即可实现两种光斑的绝对共轴，从根本上消除了光斑重合误差。系统采用波长为532 nm 的连续激光作为光源，对直径约150 nm 的金颗粒以及最小间距约50 nm 的无荧光标记聚合物线对进行成像测试，相对于传统共聚焦成像，分辨率和图像质量有了极大提升。本文报道的MSC-FED 系统结构简单紧凑，可实现优于传统扫描共聚焦显微镜2 倍的成像分辨率，推进了无标记显微成像技术的发展。鉴于本系统中采用的光纤AOM 器件的开关性能，实测光纤MSC 输出实心斑和空心斑的切换速度可达10 MHz 以上，未来系统方案可做进一步优化：在扫描振镜的每个扫描点切换一次实心斑和空心斑照明，从而实现通过扫描振镜的一次遍历扫描同时获得实心斑和空心斑照明下的两幅扫描图像的功能，进一步提升系统成像速率以及对高速运动样品的成像能力。