碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌耐药性及多位点序列分型研究*

何秀娟，宋其华，田家辰，叶惠娟，王 红，陈胜男

1.北京市昌平区医院检验科，北京 102200;2.内蒙古自治区锡林郭勒盟太卜寺旗旗医院检验科，内蒙古锡林郭勒 027000

鲍曼不动杆菌是我国医院内感染的主要条件致病菌之一，但由于抗菌药物，尤其是碳青霉烯类制剂的广泛应用，碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌(CRAB)的检出率和耐药性在逐年上升。中国细菌耐药监测研究2017—2018年革兰阴性菌监测报告显示，鲍曼不动杆菌对大多数被测抗菌药物的耐药率大于70%，其中对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率约70%，对多黏菌素E、替加环素和米诺环素的耐药率低于30%[1]。本研究主要对CRAB进行药物敏感性(以下简称药敏)分析和同源性分析，以期为临床治疗和医院内感染控制提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集北京市昌平区医院2017年1月至2019年12月从住院和门诊患者分离的鲍曼不动杆菌200株，其中CRAB有47株，2017年12株，2018年19株，2019年16株，已剔除了同一患者的重复菌株。所有菌株采用Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行鉴定，确定为鲍曼不动杆菌。药敏试验的质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853和金黄色葡萄球菌ATCC29213。

1.2方法

1.2.1药敏试验 采用Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统测定所有CRAB菌株对头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、妥布霉素、复方磺胺甲噁唑、氨苄西林/舒巴坦、替加环素、阿米卡星的最低抑菌浓度(MIC)。药敏判断参考美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2019的判断标准[2]，其中替加环素参照美国食品和药品管理局(FDA)判读标准，MIC≤2 μg/mL为敏感，MIC≥8 μg/mL为耐药。

1.2.2DNA提取 采用煮沸法来提取菌株DNA。取200 μL无菌水加入到无菌管内，取适量新鲜菌落进行稀释，100 ℃水浴10 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液存放在另一干净无菌管中，获得所需菌株DNA，在-20 ℃冰箱放置保存备用。

1.2.3多位点序列分型(MLST) 使用PCR扩增检测鲍曼不动杆菌MLST的7个管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD[3]，引物序列见表1。

表1 鲍曼不动杆菌MLST分型引物序列和产物大小

所获PCR产物送北京擎科生物技术有限公司进行测序。使用鲍曼不动杆菌基因数据库(https://pubmlst.org/abaumannii/)对测序结果进行比对，可获得各管家基因对应的等位基因编号。再按gltA-gyrB-gdhB-recA-cpn60-gpi-rpoD顺序将各菌株管家基因的等位基因编号进行排列组合，每个组合对应一个序列型(ST)，用此标识记录每株菌株的分型。如果查找不到测序结果所对应的ST，经核对后，确认为新的ST，相关数据上传数据库。最后应用eBURST 软件对ST数据开展进化关系分析。

1.3统计学处理 采用Whonet 5.6软件统计分析耐药率。

2 结 果

2.1菌株基本特征 47株CRAB标本类型以痰液(38株，80.9%)为主，其余为全血(4株，8.5%)、肺泡灌洗液(3株，6.4%)、分泌物(1株，2.1%)和脑脊液(1株，2.1%)。从男性患者中分离的菌株居多，分离自男性的有27株，占57.4%；分离自女性的有20株，占42.6%。从老年患者中分离的菌株居多，41株分离自≥65岁的患者，占87.2%；6株分离自38～<65岁的患者，占12.8%。2017—2019年检出的鲍曼不动杆菌中CRAB占比逐年上升，由2017年的18.2%增加到2019年的28.1%，主要分布在内科重症监护病房[66.0%(31/47)]、呼吸科[10.6%(5/47)]、重症监护病房[8.5%(4/47)]，不同年份CRAB占比及来源科室分布情况见表2。

表2 2017-2019年CRAB占比及来源科室分布情况

2.2药敏试验结果 检出的CRAB对头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、环丙沙星完全耐药，对氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑的耐药率在50%以上，见表3。

表3 47株CRAB药敏试验结果(%)

2.3MLST分型结果 经MLST分析获得4种ST， 其中ST208和ST195为主要分型，分别占53.2%(25株)和40.4%(19株)，其次为ST369(4.3%，2株)和ST523(2.1%，1株)，未发现新的ST，ST位点信息见表4。eBURST分析得到一个同分型组，见图1，发现这4种ST均属于克隆复合体92(CC92)，对4种ST的管家基因进行对比，发现相差仅一个管家基因(gpi)或两个管家基因(gltA、gpi)，ST208为各ST共同的祖先，其相互之间亲缘关系很近。

表4 2017—2019年分离的CRAB标本ST位点信息

图1 eBURST软件分析结果图

3 讨 论

近年来，临床上分离的重要耐药细菌，尤其是以革兰阴性杆菌为主的多重耐药细菌的检出率在快速上升，为临床抗感染治疗带来了巨大的威胁和挑战[4-5]。2017年世界卫生组织(WHO)根据对新型抗菌药物的迫切需求程度，发表了首份抗菌药物耐药“重点病原体”清单，其中CRAB被列为“极为重要”的新型抗菌药物研发重点病原体之一，其对人类生命健康已构成极大的威胁[6]。

本研究收集的200株非重复鲍曼不动杆菌中CRAB占比从2017年的18.2%增长到2019年的28.1%，呈逐年增长的趋势，但低于李荷楠等[7]、张瑞玲等[8]的报道。47株CRAB标本类型来源广泛，其中呼吸道标本(痰液)占比最高(80.9%)，呼吸系统是北京市昌平区医院收治患者的CRAB主要感染部位，与相关文献报道一致[8-10]。CRAB临床科室来源以内科重症监护室 (66.0%)为主，主要是感染免疫力低下的危急重症老年患者，也与相关报道相符[8-9]。本研究发现，CRAB不仅对碳青霉烯类抗菌药物耐药，对其他β-内酰胺类药物及含酶抑制剂复合抗菌药物的耐药率也很高。47株CRAB的药敏试验结果显示，其对临床常用的头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、环丙沙星、氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星等抗菌药物均具有极高的耐药率；对替加环素的耐药率为40.0%，也应引起足够的重视。姚丹玲等[11]研究指出，替加环素联合其他抗菌药物治疗CRAB感染并没有明显减少患者28 d的病死率，这些都给临床治疗带来了极大困难。由于危重症患者长期卧床、住院且多为高龄，呼吸道经常有大量细菌定植，临床医生应合理选用抗菌药物，根据患者的临床症状、实验室指标、影像学表现等综合分析来自呼吸道标本的CRAB是致病菌还是定植菌，以减少不恰当的治疗措施；同时，实验室工作人员必须通过涂片及染色正确评价呼吸道标本的质量，严格拒收不合格标本，多进行微生物标本送检知识的宣传，提高临床医生无菌体液标本的送检意识。

MLST是基于核酸序列进行细菌分型的方法，其操作比较简单，重复性也高，对长时期和大范围的同源性分析非常适用[12]。本研究经MLST共获得4种ST，其中以ST208和ST195为主，分别占53.2%和40.4%，均属于CC92，且暂未发现新的克隆菌株。根据报道，CRAB最主要的克隆复合体是CC92，在全球范围内广泛流行，在我国多个地区和不同医院也有分离[13-14]。不同ST在国内分布呈现地理差异性，CC92克隆复合体的传播可跨地区,具有极强的耐药性，这些菌株还可以在临床抗菌药物压力下继续存在，有极强的院内流行传播能力，研究CRAB分离株的分子流行病学对于预防医院内感染暴发尤为重要[15]。每个地区除了要预防本地流行菌株的暴发外，防止外来流行克隆株的入侵同样是重点关注的方向。

鲍曼不动杆菌的耐药机制众多，包括产生各种β-内酰胺酶、外排基因的过度表达、膜通透性的下降、水解酶的产生、生物膜的形成等[16]，如此复杂的耐药机制是CRAB在院内迅速传播的原因之一，这也是今后要持续研究探索的方向。

综上所述，北京市昌平区医院检出的鲍曼不动杆菌中CRAB的占比逐年升高，耐药形势不容乐观，定期进行流行病学监测有助于了解CRAB感染暴发流行的实际情况，能更好地为临床诊治提供可靠的依据，有利于医院内感染防控措施的制订与执行。