马铃薯多酚氧化酶酶学性质及酶促合成茶黄素能力对比

李东，张诗琪，陶迎梅，郝旺，李静雅，李宇豪

(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644005)

茶黄素类物质(theaflavins，TFs) 是红茶中非常重要的天然及活性物质来源之一，是天然的着色剂，具有抗氧化[1-3]、抗炎症[4]、降血糖、降血脂[5]等多种功能。外源酶促氧化法合成茶黄素成为现阶段高效制备TFs的方法，即儿茶素类物质在多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)的催化作用下合成TFs[6]。研究者们[7-14]通过多种植物酶源研究不同PPO对儿茶素酶促氧化合成茶黄素的影响，但因不同植物源的PPO的结构、组织、发育期表达等方面的不同，酶的催化作用及其底物特性之间差异性较大[15]。本团队前期对马铃薯、红薯、芋头、山药、苹果、丰水梨、贡梨、香蕉、李子、青枣10种植物来源的PPO催化茶黄素的能力进行了研究，发现将马铃薯PPO作为植物酶源催化儿茶素具有较强催化合成TFs的能力。但由于马铃薯具有多个品种，品种的不同使酶活力和同工酶表现出时空特异性[16]，TFs产量及其各单体间的比例因马铃薯品种不同而具有差异性。目前马铃薯PPO的酶促褐变[17]及活性分析[18]成为许多学者的研究热点，但针对不同马铃薯PPO合成各茶黄素单体及TFs的选择的研究鲜有报道。因此，本研究结合马铃薯PPO酶学性质的对比，通过不同品种马铃薯PPO酶促氧化茶多酚合成TFs的能力来筛选出最佳的马铃薯品种，将为工业化制备高产量TFs提供一定的酶促原料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马铃薯(黄心、黑美人、大牛角、红玫瑰、大白花)：新鲜市售；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、邻苯二酚、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)：均为分析纯，成都科隆化学品有限公司；茶多酚：上海麦克林生化科技有限公司；茶黄素(theaflavin，TF)、茶黄素-3-没食子酸酯(theaflavin-3-gallate，TF-3-G)、茶黄素-3′-没食子酸酯(theaflavin-3'-gallate，TF-3'-G)、茶黄素-3,3'-没食子酸酯(theaflavin-3,3'-gallate，TF-3,3'-G)：标准品，纯度均大于98%，成都德思特生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100高效液相色谱仪、EC-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm, 2.7 μm) 美国Agilent科技有限公司；PHS-3E pH计、N5000 Plus分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；HZ150L恒温培养摇床 武汉瑞华仪器设备有限责任公司；TG16高速离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；M1-L23B美的微波炉 广东美的厨房电器制造有限公司；JJ-2B组织匀浆机 金坛区指前镇旭日实验仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 多酚氧化酶酶液的制备

参考崔晓颖等[19]提取芋头PPO的方法进行修改，采用匀浆浸提法提取不同品种马铃薯PPO。分别称取等量不同品种切块马铃薯，加入到400 mL含1% PVPP的预冷磷酸盐缓冲液中(0.05 mol/L，pH 7.6)，用组织匀浆机匀浆5 min，将匀浆液放入4 ℃冰箱中提取12 h，过滤后离心(4 ℃， 8 500 r/min， 30 min)，离心后以上液作PPO酶液。

1.3.2 PPO酶活力的测定

PPO酶活力参考袁斌等[20]对酶活的检测方法并进行修改，使用分光光度计进行酶活力的测定。取1.5 mL缓冲液和0.5 mL PPO酶液于25 ℃水浴中4 min后，迅速加入0.5 mL邻苯二酚溶液，记录30 s内420 nm处吸光度的相对变化幅值，重复3次。空白对照以灭活酶代替。酶活力定义：吸光度在420 nm处1 min内变化0.001为一个酶活力单位(U)。

式中：ΔOD420为反应时间内吸光度变化值，t为反应时间(min)，V1为酶提取液的总体积(mL)，V2为取样比色体积(mL)。

1.3.3 蛋白质含量的测定

蛋白质浓度利用考马斯亮蓝法[21]进行测定，建立蛋白质含量标准曲线：

Y=0.104 77X+0.087 6(R2=0.999 2)。

式中：以蛋白质质量浓度为横坐标X，吸光度为纵坐标Y。

取10 μL酶液加水稀释10倍，加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，混匀后在595 nm波长下测定吸光度值，计算待测蛋白样品含量。

将比活力(U/mg)定义为每毫克蛋白质所含有的酶活力数。

1.3.4 酶学性质对比

1.3.4.1 不同品种马铃薯PPO最适反应温度的对比

分别取不同品种马铃薯PPO酶液0.5 mL，设置反应温度分别为20，30，40，50，60，70，80 ℃，参照“1.3.2”对酶活力进行测定。

1.3.4.2 不同品种马铃薯PPO最适反应pH的对比

分别取不同品种马铃薯PPO酶液0.5 mL，设置酶反应体系缓冲液pH分别为5.6，6.0，6.4，6.8，7.2，7.6，8.0，参照“1.3.2”对酶活力进行测定。

1.3.4.3 不同品种马铃薯最适反应底物浓度的对比

在前期已对几个不同底物进行对比，选择邻苯二酚作为底物其酶活性相对较高。分别取不同品种马铃薯PPO酶液0.5 mL，设置邻苯二酚浓度分别为20，30，40，50，60，70，80，90 mmol/L，参照“1.3.2”对酶活力进行测定。

1.3.5 不同品种马铃薯PPO酶促制备茶黄素类物质生成量的对比

参考黄莹捷等[22]对勐库大叶种PPO进行酶促反应合成茶黄素方法进行修改。酶促反应体系由浓度为5 mg/mL的反应底物溶液(茶多酚与磷酸缓冲液)与5 mL的马铃薯PPO溶液组成。放入摇床中30 ℃剧烈振荡90 min。在反应完成后，放入100 ℃水浴锅中保持10 min终止反应。5 000 r/min离心10 min后取上清液过0.22 μm微孔滤膜，所得滤液进行HPLC测定。

1.3.6 茶黄素类物质含量的测定

采用EC-C18色谱柱，流动相分别为0.1%甲酸溶液和乙腈溶液，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，检测波长280 nm。梯度洗脱程序见表1。根据该色谱条件测定茶黄素类物质的生成量。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedures

1.3.7 数据处理

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 22进行数据处理，采用Waller-Duncan检验方法进行多重比较，使用Origin 2021作图。

2 结果与分析

2.1 不同品种马铃薯PPO酶蛋白含量及其酶活力的对比

在相同条件下对不同品种马铃薯PPO进行酶蛋白含量测定，结果见图1。马铃薯的酶促褐变程度通常可以用酶蛋白含量来表示。5个品种中黄心马铃薯PPO酶蛋白含量显著高于其余4个品种，达到(170.45±5.20) mg，最易褐变，大白花马铃薯PPO酶蛋白含量最低，为(80.64±15.32) mg，相对于其余4个品种PPO最不易发生酶促褐变。在相同适宜环境下，测定5个品种PPO的酶活力及比活力，结果见表2。通过5个品种酶活力与比活力的对比，可知黄心马铃薯、大牛角马铃薯两种PPO表现出高酶活力。

图1 不同品种马铃薯PPO酶蛋白含量Fig.1 Content of PPO enzyme protein in different varieties of potatoes

表2 不同品种马铃薯PPO酶活力及比活力Table 2 PPO enzyme activity and specific activity of different varieties of potatoes

2.2 反应温度对不同品种马铃薯PPO酶活力的影响

在不同温度下测定5个品种马铃薯PPO酶活力，结果见图2。

图2 不同品种马铃薯PPO在不同温度下酶活力Fig.2 PPO enzyme activity of different varieties of potatoes at different temperatures

由图2可知，在反应温度从20 ℃增至80 ℃的过程中，PPO的相对酶活力整体呈现出先增加后减少的变化趋势。黄心、红玫瑰、黑美人和大白花PPO在温度为30 ℃时酶活力分别达到最大值，其酶活力均显著高于该品种下不同温度的酶活力。大牛角PPO在温度为40 ℃时酶活力达到最大值，在不同温度下酶活力的差异具有统计学意义。

最适温度即在该温度下其酶活力达到最大值。黄心、红玫瑰、黑美人和大白花PPO在温度为30 ℃时酶活力分别达到最大值，即30 ℃为最适温度。大牛角PPO在温度为40 ℃时酶活力达到最大值，即最适温度为40 ℃。对比最适温度下5种不同马铃薯PPO酶活力可以看出，黄心、大牛角和黑美人PPO酶活力较高，大白花PPO酶活力最低。不同PPO的最适温度不同，但都在30～40 ℃之间，在80 ℃下几乎丧失了酶活力。

2.3 反应pH对不同品种马铃薯PPO酶活力的影响

在不同pH值缓冲液中测定5种马铃薯PPO酶活力，结果见图3。

图3 不同品种马铃薯PPO在不同pH下酶活力Fig.3 PPO enzyme activity of different varieties of potatoes at different pH values

由图3可知，随着pH的增大，不同品种马铃薯PPO均呈现先增大后减小的趋势。其中黑美人与红玫瑰马铃薯PPO在pH为6.0时酶活力达到最大值，即pH 6.0是该两个品种的最适pH。黄心马铃薯PPO与大白花马铃薯PPO在pH为6.8时酶活力达到最大值，分别为334 U和199.67 U。大牛角PPO在pH为7.2时酶活力达到最大值，为321.33 U。

李俊等[23]测定了4个品种马铃薯PPO的最适pH在6.0～7.0之间，其中黑美人PPO最适pH在6.0。朱新鹏等[24]对7个品种马铃薯PPO在不同条件下进行了测定，其PPO最适pH值均在5.6～6.8。其结果与本实验结果基本一致，马铃薯PPO的最适pH均在同一范围内，为6.0～7.2。对比最适pH下5种不同马铃薯PPO酶活力可以看出，黄心马铃薯PPO酶活力最高，大白花马铃薯PPO酶活力最低。

2.4 反应底物浓度对不同品种马铃薯PPO酶活力的影响

选择邻苯二酚为反应底物，分别以不同浓度进行酶反应，测得不同品种马铃薯PPO的酶活力，结果见图4。

图4 不同品种马铃薯PPO在不同底物浓度下酶活力Fig.4 PPO enzyme activity of different varieties of potatoes under different substrate concentrations

由图4可知，随着底物邻苯二酚浓度的增加，酶促反应速率随着底物浓度的增加逐渐加快，5个品种马铃薯PPO酶活力显著增高，当邻苯二酚达到一定浓度时，酶活力随着浓度的增加而趋于稳定，这是因为PPO与底物邻苯二酚结合达到饱和[25]。

在达到最适底物浓度后，PPO酶活力大小依次为：大牛角PPO(473.33 U)>红玫瑰PPO(432.67 U)>黄心PPO(401.33 U)>黑美人PPO(384.67 U)>大白花PPO(295.33 U)。大白花酶活力最低，与前面反应温度和pH结果一致。

2.5 不同品种马铃薯PPO对酶促制备茶黄素类物质生成量的影响

对5个品种马铃薯PPO进行酶促制备茶黄素类物质，结果见图5。

图5 不同品种马铃薯PPO酶促制备茶黄素类物质生成量Fig.5 Production amount of theaflavins prepared by enzymatic reaction of PPO from different varieties of potatoes

由图5可知，在茶黄素4个单体生成中，TF的生成量最多，其次是TFDG，再次是TF-3-G和TF-3'-G。由此可以看出，马铃薯PPO催化儿茶素类物质对转化为茶黄素单体的合成量存在差异，即对TF和TFDG的转化具有一定程度的定向性，对该两种茶黄素单体的酶促合成存在一定的优势。

经SPSS显著性差异分析，不同品种马铃薯PPO对TFs生成量存在显著性差异。黄心马铃薯PPO对TFs的生成量最高，为129.71 μg/mL。大白花马铃薯PPO对TFs的生成量最低，约为黄心马铃薯PPO对TFs生成量的一半。

不同品种马铃薯对4种茶黄素单体的生成量也存在显著性差异。黄心马铃薯PPO对酶促生成4种茶黄素单体均显著高于其他品种。黄心PPO、大牛角PPO和红玫瑰PPO对TF-3-G的生成量较高(25.61，22.71，22.15 μg/mL)，大白花PPO对TFDG的生成量最低，为18.66 μg/mL。

3 讨论

3.1 马铃薯PPO酶学性质及其对合成茶黄素的影响

改变温度能够带来酶蛋白活动中心结构的变化，酶活力的丧失来自于蛋白空间构型的改变[26]。马铃薯PPO在30～40 ℃范围内保持较高酶活力，说明在此范围内仅有部分PPO构型发生改变，酶活力保持在较高水平。在最适温度下，分子动能最大，酶活性最强，但随着温度的升高，酶的空间结构发生变化，最终导致酶活性丧失。茶黄素的生成及在PPO的分离过程中，温度是重要的因素之一。温度的变化能对PPO活性进行调控，进而影响茶黄素生成的品质[27]。本实验测得不同品种马铃薯PPO最适反应温度在30～40 ℃。Li等[28]对马铃薯PPO酶促合成TFs进行了条件优化，可知马铃薯PPO酶促制备TFs的最适温度为30 ℃，在马铃薯PPO最适温度范围内，说明在马铃薯PPO最适温度下，PPO活性较为适宜，其PPO的活性利于TFs的生成，不会导致茶褐素的生成。

不同品种PPO最适pH也有一定的差别，但最适pH范围在6.0～7.2之间，其酸碱环境为弱酸性和中性。这是因为PPO酶活性中心具有Cu2+，在强酸性条件下Cu2+易发生解离，使PPO酶活性降低；在强碱性条件下Cu2+解离后极易生成氢氧化铜沉淀，使酶活性大幅度降低[29]。PPO酶活力会因为反应pH影响酶活性中心和蛋白质结构而改变。有分析表明在偏酸性条件下更有利于茶黄素的形成，并且在酸性环境下茶黄素更加稳定[30]。通过得出马铃薯PPO的最适pH为偏酸和中性，为后续从PPO合成TFs提供了适宜酸碱环境，从而在合成TFs过程中易保持较高的酶活性。

本研究以邻苯二酚作为反应底物，通过改变浓度得出不同品种马铃薯PPO的最适反应浓度，不同品种PPO最适反应浓度不同，这是因为不同品种PPO对底物的亲和力不同，其底物的亲和力与酶源的构成有关。有研究表明[31]，PPO对多种二酚类物质均具有催化作用，其中在邻苯二酚作为底物时，能够表现出较强的结合能力。PPO与底物结合能力的差异是通过酶活力的差异来表现的，在酶促氧化合成茶黄素时，茶多酚中含有一定量的酚类物质与PPO发生反应，PPO的底物专一性和底物浓度会在不同程度上影响其酶活性，从而影响茶黄素的酶促合成。

酶分子因能够增大化学反应效率而常用来作催化反应的催化剂，它也是酶促反应的原动力，其酶促反应效率可用PPO酶活力来表示。研究表明[32-33]，高酶蛋白和酶活力对酶促制备茶黄素具有高催化作用。黄心马铃薯、大牛角马铃薯、红玫瑰马铃薯3种PPO表现出高酶活力和高酶蛋白，是接下来筛选合成茶黄素PPO最适品种的重点，同时为后续验证PPO酶活力是否与酶促合成TFs的能力呈现正相关提供了思路。

3.2 不同马铃薯PPO对酶促合成茶黄素的影响

不同品种马铃薯PPO酶促合成TFs及各茶黄素单体的能力存在差异。通过前面不同品种PPO酶学性质的对比可知，一般情况下酶活力高的其酶促合成能力强，但酶蛋白含量也与茶黄素合成能力有关。有研究指出茶黄素合成量除与酶活性呈正相关外[34]，还与PPO同工酶的组成有关。在多条同工酶谱带共同作用下，PPO能催化儿茶素合成茶黄素。PPO在马铃薯的组织器官中普遍存在[35]，Thygesen等为研究马铃薯PPO酶活力的变化规律，对马铃薯生长过程中块茎、叶片等在不同时期的PPO进行了酶活力测定与同工酶谱带检测，发现PPO酶活力和同工酶数量均表现出时空特异性，随着植物生长时期的变化而变化，这是造成不同品种马铃薯PPO酶活力及酶促合成茶黄素生成量不同的重要原因，而同工酶对其茶黄素合成具体的影响还需继续深入研究。

在马铃薯中，编码PPO的核基因至少有6个，PPO活性中心的铜离子结合区具有两个构象Cu A和Cu B，其具有高度同源性。酶促反应合成是因铜离子与多酚类物质结合并靠近活性中心，使分子结构和相关基因排列发生改变而存在[36]。酶活性中心结构的多样性赋予了PPO底物特异性，PPO与底物之间的作用取决于活性中心附近的氨基酸，品种的不同造成氨基酸的不同，从而影响不同品种马铃薯PPO生成茶黄素的种类和合成量不同。

4 结论

通过5个品种马铃薯PPO结合酶学性质和酶促制备茶黄素能力的对比，筛选出最适生成茶黄素的马铃薯PPO品种为黄心马铃薯。证实茶黄素的生成量不仅与酶活力呈正相关，还与酶含量有关，PPO酶含量也决定着儿茶素催化茶黄素的能力。相较于其他4个品种PPO而言，黄心马铃薯PPO粗酶的最适反应温度和pH相对较低，利于茶色素的生成和保留。在测定其酶活力时选择邻苯二酚作为底物，黄心马铃薯PPO的最适底物浓度为50 mmol/L，为后续分离纯化PPO时测定酶活力提供了条件。本文对不同品种马铃薯PPO的酶学性质及酶促制备茶黄素的能力进行了对比研究，有利于更好地对酶活性进行调控，从而为马铃薯PPO的分离纯化及茶黄素制备提供理论依据。