超声辅助酶法提取山荆子果胶工艺优化及其红外光谱特征

李泽林，沈晋如，方敏瑞，赵春燕，范江平，沈晓静,2，3*，郑婷婷

(1.云南农业大学 食品科学技术学院，昆明 650201；2.昆明医科大学 云南省天然药物药理重点实验室，昆明 650500；3.云南农业大学 理学院，昆明 650201；4.普洱茶研究院，云南 普洱 665099)

山荆子(Malusbaccata(L.) Borkh.)又叫山丁子、林荆子、山定子和海棠果，是蔷薇科苹果属多年生木本植物，主要分布于朝鲜、俄罗斯及我国东北、华北、西南等地区[1-2]。山荆子果实含有表儿茶素、花青素等活性成分，可用于缓解儿童排尿困难、关节疼痛和炎症等症状[3]。成熟的山荆子鲜果具有酸甜适中的独特风味以及含有大量的果胶多糖类物质[4]，其常被用来制作糕点、饮料、果酒等食品。周慧等[5]联用均匀设计和模糊数学方法，优化了茯苓山荆子果糕的加工工艺。童观珍等[6]采用响应面法优化了山荆子果汁饮料配方。高志霞等[7]采用正交实验优化了山荆子葡萄复合果酒工艺。这些对山荆子食品的开发研究促进了山荆子的综合利用。但对山荆子果胶的提取研究目前尚未见报道。

果胶是一类以D-半乳糖醛酸为主要组成成分的酸性杂多糖。因果胶具有绿色天然、无毒环保的特点被广泛用于食品生产加工[8]。另外，果胶溶液黏度比低、流动性好，1%果胶溶液具有假塑性流体的部分特性以及良好的胶凝度，也常被作为功能性食品添加剂用于改善加工食品和调味制品的外观、组织、口感以及生物利用度[9-10]。目前，果胶被广泛应用于果酱、酱料、面包、饮品、果冻、软糖等产品中[11]。

超声辅助酶法提取技术具有提取时间短、提取率高、成本低、低温保护热敏性成分等优点，被广泛应用于植物基果胶的提取[12]。本实验拟采用响应面法优化山荆子果胶的超声辅助纤维素酶提取工艺，并检测其总糖含量、酯化度、乙酰化度等指标，再采用傅里叶红外光谱表征其组成，旨在为丽江山荆子果胶的综合开发利用以及结构初探提供一定的理论依据及实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丽江山荆子鲜果：云南省丽江市；纤维素酶(10 000 U/g)：玛雅试剂有限公司；透析袋MD34(7 000 D)：上海源叶生物科技有限公司；AB-8大孔树脂：河北美凯化工有限公司；三氯甲烷(AR)：重庆川东化工有限公司；正丁醇(AR)：广东光华科技股份有限公司。

1.2 仪器设备

SCIENTZ-48高通量组织研磨器 宁波新芝生物科技股份有限公司；DHG-9070A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；H3-18K台式高速离心机 湖南可成仪器设备有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SCQ-9201B超声波提取仪 上海声彦超声波仪器有限公司。

1.3 果胶提取方法

将采自云南丽江的山荆子鲜果去除果叶、果柄和果核后清洗干净，于55 ℃烘箱中烘干至含水率低于5%，粉碎，过80目筛，备用。准确称取20 g果粉和果粉质量3%的纤维素酶，用500 mL纯水充分溶解并调节pH至4.5后于55 ℃酶解90 min，沸水灭酶5 min，超声25 min，过滤后旋转蒸发至原体积的1/3，得到果胶提取液。加入等体积的乙醇，混匀，于4 ℃冰箱中过夜后离心(5 000 r/min)去上清液，将剩余固体真空冷冻干燥后得到粗果胶，并按照下式计算果胶提取率：

式中：m为干燥后粗果胶质量；m0为山荆子果粉质量。

1.4 果胶提取单因素实验

1.4.1 超声时间对果胶提取率的影响

考察超声时间对山荆子果胶提取率的影响：固定纤维素酶添加量1.15%、pH 4.5、酶解温度55 ℃、酶解时间2 h、超声温度55 ℃和料液比1∶18，设置超声时间分别为10，15，20，25，30 min，对山荆子果胶进行提取，计算果胶提取率。

1.4.2 酶解时间对果胶提取率的影响

考察酶解时间对山荆子果胶提取率的影响：固定纤维素酶添加量1.15%、pH 4.5、酶解温度55 ℃、超声温度55 ℃、超声时间25 min和料液比1∶18，设置酶解时间分别为1，1.5，2，2.5，3 h，对山荆子果胶进行提取，计算果胶提取率。

1.4.3 酶添加量对果胶提取率的影响

考察酶添加量对山荆子果胶提取率的影响：固定pH 4.5、酶解温度55 ℃、酶解时间1.5 h、超声温度55 ℃、超声时间25 min和料液比1∶18，设置酶添加量分别为果粉的1%、1.5%、2%、2.5%、3%，对山荆子果胶进行提取，计算果胶提取率。

1.5 响应面实验

在单因素实验的基础上，运用Box-Behnken设计三因素三水平响应面实验，并以果胶提取率为响应指标(%)，见表1。

表1 响应面分析因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.6 理化指标检测

参考李晓娟等[13]的苯酚-硫酸法测定果胶的总糖含量；参考Kaya等[14]的福林酚比色法测定果胶的多酚含量；参考Patience等[15]的考马斯亮蓝法测定果胶的蛋白质含量；参照国标GB 5009.3—2016中的直接干燥法测定纯化果胶的水分含量；参考Chen等[16]的皂化滴定度法测定果胶的酯化度；参考Shivamathi等[17]的化学滴定法测定果胶的乙酰化度。

1.7 红外光谱检测

准确称取果胶样品1 mg，采用KBr压片法进行检测，在500～4 000 cm-1范围内进行扫描。

1.8 数据处理

采用Microsoft Excel 2010数据统计软件分析处理实验数据，采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面实验设计与分析；每组实验均重复3次，实验结果求平均值并以“平均值±标准差(SD)”表示。

2 结果分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 不同超声时间对山荆子果胶提取率的影响

图1 单因素实验结果Fig.1 The results of single factor experiments

超声时间对山荆子果胶提取率的影响见图1中a。在不同超声时间的影响下，果胶提取率呈现先上升后下降的趋势，当超声时间为25 min时，果胶提取率最高，为(5.93±0.13)%。当超声时间超过25 min时，果胶提取率呈现缓慢降低的趋势，这可能是因为超声波具有强力的机械切割作用，长时间的作用可能使果胶被破坏，从而减少提取率。所以，选择超声时间25 min为最优值。

2.1.2 不同酶解时间对山荆子果胶提取率的影响

酶解时间对山荆子果胶提取率的影响见图1中b。在不同酶解时间的影响下，在1.0～1.5 h内随着时间的增加果胶提取率逐渐增大，当酶解时间为1.5 h时，果胶提取率最高，为(8.85±0.26)%。当酶解时间超过1.5 h时，纤维素酶已经充分作用，果胶溶出量不再增加，继续延长酶解时间，部分水溶性果胶水解以及超声的空化作用破坏了果胶结构,导致提取率降低。所以，选择酶解时间1.5 h为最优值。

2.1.3 不同酶添加量对山荆子果胶提取率的影响

酶解液中纤维素酶添加量对果胶提取率的影响见图1中c。在纤维素酶添加量为1.0%～2.5%时，果胶提取率随着纤维素酶添加量的增加而上升，提取率达到最大值(13.60±0.16)%时所需酶添加量为2.5%；当纤维素酶添加量为2.5%～3.0%时，随着纤维素酶添加量的增加，果胶提取率反而下降。原因可能是当纤维素添加量过多时，酶解液浓度过高，这些酶出现过饱和而相互附着的“抱团”现象，降低了整体的活性，影响了果胶的提取。所以，选择酶添加量2.5%为最优值。

2.2 响应面实验结果分析

2.2.1 模型建立及显著性检验

果胶提取响应面实验设计与结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回归统计分析结果Table 3 Regression statistical analysis results

续 表

由表3回归分析和方差分析可知，该回归模型是显著的(P<0.05)。在各响应因素中，一次项C(酶添加量)的P<0.01，表明该因素对果胶得率有极显著影响。二次项A2的P<0.05，表明超声时间对果胶提取率有显著影响。

模型的失拟项不显著(P>0.05)，说明实际值与预测值之间无失拟存在，方程拟合性好，实验误差小。根据各因素显著水平，结合F值大小可以判断，各单因素对果胶提取率影响程度的主次顺序为C(酶添加量)>B(酶解时间)>A(超声时间)。以超声时间(A)、酶解时间(B)、酶添加量(C)为自变量，以山荆子果胶得率为因变量，对各组合处理得到的果胶得率进行二次回归分析，建立多元二次响应面回归模型：果胶提取率=13.22-0.33A+1.49B+3.86C-0.28AB-0.77AC-2.71BC-3.14A2-1.28B2+0.31C2。

2.2.2 交互作用分析

图2 各因素交互作用对果胶提取率影响的三维曲面和等高线Fig.2 Three-dimensional surface diagrams and contour lines of the effects of interaction of various factors on the extraction yield of pectin

响应面图的弧度与等高线的密集程度反映了各因素作用的大小。各因素的交互作用对响应值的影响可通过等高线直观地反映出来，等高线的形状可以反映出各因素交互效应的强弱，等高线为椭圆形表明两因素的交互作用对果胶提取率的影响作用显著，当等高线呈圆形时，则表明两因素的交互作用不显著[18-19]。由图2中a可知，超声时间A和酶解时间B的交互作用响应面图呈现了果胶提取率先增大后减小的趋势，说明两者对果胶提取率有影响，但是等高线呈圆形，说明两者的交互作用无显著差异。由图2中b和c可知，响应曲面图较陡峭，由图形弧度及等高线密度可知纤维素酶添加量对果胶提取率的影响比酶解时间和超声时间对果胶提取率的影响大，但是没有显著差异。交互作用分析结果与方差分析表中的结果相一致。

2.2.3 最佳工艺条件的预测与模型验证

根据以上模型得到最佳提取工艺条件：超声时间24.23 min，酶解时间1.27 h，纤维素酶添加量3%，理论上得到山荆子果胶提取率为17.75%。在此条件下进行3组平行实验验证，得到实际的山荆子粗果胶提取率为(17.70±0.28)%，与模型理论值相接近且无显著差异，证明该数学模型优化的最佳工艺参数具有可行性和重现性。

2.3 山荆子果胶理化指标检测结果

进一步对山荆子果胶的理化指标进行检测，结果见表4。使用超声辅助酶法提取的山荆子果胶总糖和多酚含量较高，分别达到了(78.59±3.76)%和(26.10±0.11)%；但是，其蛋白质含量和含水量较低，仅为(0.20±0.07)%和(3.71±0.07)%。此外，从山荆子果胶中检测到酯化度和乙酰化度分别为(65.00±0.04)%和(15.83±0.13)%。这些结果说明该方法提取的果胶是高酯果胶并且具有一定的纯度，但是还可以进一步纯化。

表4 山荆子精果胶理化指标Table 4 Physicochemica lindexes of pectin from Malus baccata (L.) Borkh.

2.4 红外光谱结果分析

图3 山荆子果胶的FT-IR

3 结论

本研究采用超声辅助酶法提取山荆子果胶工艺，最佳提取条件为超声时间24.23 min，纤维酶添加量3%，酶解时间1.27 h，山荆子果胶实际提取率为(17.70±0.28)%；使用超声辅助酶法提取的山荆子果胶总糖和多酚含量较高，分别达到了(78.59±3.76)%和(26.10±0.11)%，蛋白质含量较低，为(0.20±0.07)%；此外，红外光谱显示山荆子果胶是一类含有典型多糖结构的高酯果胶。本研究可为云南丽江山荆子的综合利用和其果胶结构特性研究提供前期基础和理论依据。