基于ITS2序列的鬼箭羽及其混伪品DNA条形码鉴定

郭丽嵘 ，赵伟 ，杨丽 ，陈海娟 ，杨志刚 ， ，李一蒙， ，

1.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.青海师范大学高原科学与可持续发展研究院，青海 西宁 810016；3.青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海 西宁 810008；4.兰州大学陇药协同创新中心，甘肃 兰州 730000

鬼箭羽始载于《神农本草经》，列为中品，为卫矛科植物卫矛Euonymus alatus（Thunb.）Sieb.的干燥具翅状物的枝条或翅状物[1]。全国除东北、新疆、青海、西藏、广东及海南外，其余各地均产，具有较高的药用、观赏及经济价值。鬼箭羽含有丰富的化学成分，包括黄酮类、甾体类、木脂素类、强心苷类、生物碱类、苯丙素类、萜类、挥发油类、酚酸类等[2-3]。古籍记载鬼箭羽主要用于治疗女子妇科经血疾病及杀虫驱邪。药理研究表明，鬼箭羽提取物有明显的降血糖、降血脂、降血压、抗过敏、抗炎及保护肾小管上皮细胞等作用，在治疗糖尿病、慢性肾炎、盆腔炎、类风湿关节炎等方面效果显著[4-6]。卫矛属植物众多，分布广泛，植物形态相似，极易混淆，鉴别难度大。《千金翼方》记载，鬼箭羽与天麻苗均具有赤箭、鬼督邮等别称。明代《本草崇原》将天麻苗描述为“赤箭。春生苗，中抽一茎直上如箭竿，色正赤，贴茎梢之半，微有小红叶，远看如箭之有羽，根形如王瓜，皮色黄白，晒干则黑，去根三五寸，有游子环列如卫，皆有细根如白发，气相通而实不相连”，由此可知，兰科植物天麻在形态上与鬼箭羽相似。这导致正品与伪品混用现象层出不穷，给用药安全带来很大隐患。因此，为控制鬼箭羽药材质量，建立一种快速准确的鉴别方法尤为重要。

传统的药材鉴别手段主要包括性状鉴定、基原鉴定、显微鉴定及理化鉴定等。随着分子生物学的发展，DNA条形码分子鉴定法的出现对传统鉴别手段进行了有效补充。DNA条形码技术是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA片段对物种进行鉴定，不受样品的形态和性状的影响[7-8]。目前，植物类中药材常选用细胞核基因组中的ITS2（Internal Transcribed Spacer 2）和叶绿体基因组中的psbA-trnH基因区间序列进行鉴别。本研究将DNA条形码技术用于鬼箭羽药材的鉴别，比较鬼箭羽与其近源种的亲缘关系，建立快速鉴别鬼箭羽及其混伪品的方法，为后续鬼箭羽的质量控制及安全用药提供分子依据。

1 仪器与试药

GE9612T-S型聚合酶链式反应（PCR）扩增仪（北京柏恒科技有限公司），ChampGel 6000型全自动凝胶成像分析系统（北京赛智创业科技有限公司），D1524R型高速冷冻离心机（北京大龙兴创实验仪器有限公司），DYY-6C型琼脂糖凝胶电泳仪（北京六一生物科技有限公司），Vortex 3000型涡旋混合器（WIGGENS labortechink GmbH公司），Nano-400A型超微量核酸分析仪（杭州奥盛仪器有限公司），Smart-S15型超纯水系统（上海和泰仪器有限公司）。

Genomic DNA Kit试剂盒（批号P81019）、DNA凝胶回收试剂盒（批号03921KE1），北京全式金生物技术股份有限公司；GelstainRed核酸染料（批号210611L1-7），上海百赛生物技术股份有限公司；100 bp Marker（批号01000/60531），康为世纪生物科技股份有限公司；KOD-Plus-Neo（批号067000），TOYOBO；西班牙琼脂糖（批号111860）、50×TAE电泳缓冲液（批号21335470）、6×DNA loading buffer（批号01454/36320），兰州励合生物科技有限公司。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

16批鬼箭羽药材，分别为来源于四川、河南、山东、江西等地的野生种（见表1），经兰州大学药学院李建银讲师鉴定，为卫矛科植物卫矛Euonymus alatus（Thunb.）Sieb.的干燥具翅状物的枝条或翅状物。鬼箭羽近源种西南卫矛Euonymus hamiltonianus、欧洲卫矛Euonymus europaeus、白杜卫矛Euonymus maackii、冬青卫矛Euonymus japonicus、卫矛Euonymus alatus、扶芳藤Euonymus fortunei、紫花卫矛Euonymus porphyreus、栓翅卫矛Euonymus phellomanus及混伪品大果榆Ulmus macrocarpa序列均来源于GenBank数据库（见表2）。

表1 鬼箭羽样品来源信息

表2 鬼箭羽近源种及其伪品序列信息

2 方法与结果

2.1 ITS2序列分析

2.1.1 DNA提取、PCR扩增及测序

用酒精擦拭药材表面，待药材表面酒精挥干，粉碎后过5号筛，称取样品粉末约20 mg，使用全式金Genomic DNA Kit试剂盒提取总DNA。使用通用引物ITS2F （5” -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3” ） 和ITS3R（5” -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3” ）进行ITS2序列扩增。PCR总反应体系为50 μL，扩增程序为：94 ℃变性2 min；98 ℃、10 s，55 ℃、30 s，68 ℃、45 s，33个循环；94 ℃，5 min，4 ℃保存。DNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后将扩增的基因送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行一代测序。

2.1.2 种内及种间遗传距离分析

琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增产物长度为450～470 bp，条带清晰无裂解（见图1），表明ITS2序列扩增效果好，纯化回收后测序可获得高质量的碱基序列。测序后去除两端5.8S和28S rDNA区段获得ITS2标准序列，其长度为212 bp，GC含量为67.4%～67.9%。序列对比结果表明，16条序列仅在第100个位点处存在差异，其中，GJY4、GJY5、GJY6、GJY9、GJY10、GJY14为C，其他样品为T，共获得2个单倍型（见图2），表明不同产地所产鬼箭羽的种内变异率低，具有较高的遗传稳定性。基于K2P双参数模型计算遗传距离，不同产地不同药材市场鬼箭羽的种内最大K2P为0.004 7，平均K2P为0.002 4，种间最大K2P为0.126 2，种间平均K2P为0.082 1，鬼箭羽与混伪品最小K2P为0.405 8，最大K2P为0.430 6，见表3～表4。

表3 鬼箭羽样品种内遗传距离

表4 鬼箭羽与近源种和混伪品的遗传距离

图1 鬼箭羽样品ITS2扩增片段琼脂糖凝胶电泳

图2 鬼箭羽样品间ITS2序列对比

2.2 系统发育分析

测序峰图利用CodonCode Aligner 3.0校对拼接，去除低质量区和引物区，获得一致性序列。所有序列使用隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8S和28S区段获得ITS2间隔区序列，其中5.8S rRNA的保守序列为CGAGGGCACGCCTGCCTGGGTGTCA，28S rRNA的保守序列为CGACCCCAGGTCAGG CGGGAACACC。将得到的所有序列用Molecular Evolutionary Genetics Analysis 7.0软件分析比对后用邻接（NJ）法构建系统聚类树，利用bootstrap（1 000次重复）检验各分支的支持率。

使用MEGA 7.0软件对NCBI数据库选取的8种近源种及1种伪品和16批鬼箭羽药材ITS2序列构建NJ系统聚类树（见图3）。系统聚类树结果表明，GJY1～GJY16与西南卫矛、欧洲卫矛、白杜卫矛、冬青卫矛、扶芳藤、栓翅卫矛、紫花卫矛并为一个大分支，可以明显看出，GJY1～GJY16与卫矛属材料亲缘关系较近，而其伪品大果榆自成一支，表明ITS2序列作为DNA条形码，能将鬼箭羽与其混伪品分开。

图3 基于ITS2序列构建的鬼箭羽及其混伪品NJ系统发育树

3 讨论

中药材DNA条形码分子鉴定指导原则已被列入2020年版《中华人民共和国药典》（四部）通则，在中药鉴定方面广泛研究与应用，为传统中药鉴定学的发展提供了新的理论和技术支撑[9-10]。刘金欣等[11]通过建立黄芩ITS2数据库并对黄芩种子的ITS2序列进行分子鉴定，发现黄芩的种内序列变异小于种间序列变异，构建的黄芩ITS2条形码数据库稳定可靠，表明DNA条形码可用于黄芩种子的物种鉴定。孙稚颖等[12]通过鉴定羌活及其混伪品的ITS2序列并比较了ITS2的二级结构，发现羌活种内平均遗传距离远小于与其混伪品的种间平均遗传距离，ITS2结构上也有明显差异，表明ITS2序列作为DNA条形码可方便快捷地鉴别羌活与其混伪品。

1963年版《中华人民共和国药典》将鬼箭羽的来源描述为卫矛科植物卫矛的干燥具翅状物枝条[13]。1993年版《河南省中药材标准（二）》记载鬼箭羽药材来源为卫矛科植物卫矛E. alatus、同属植物栓翅卫矛E. phellomanus及同属植物毛脉卫矛E. alatusvar.pubescens[14]。2009年版《甘肃省中药材标准》亦有类似说明[15]。目前，鬼箭羽基原已基本确定为卫矛科植物卫矛，随着临床应用日益增多，在市场流通过程中常有榆科植物大果榆的茎冒充鬼箭羽，值得注意的是，大果榆的干燥茎亦具有不规则木栓翅，判定时仍存在困难，使用时应注意鉴别[16-17]。

本研究采用DNA条形码技术，通过对不同产地不同药材市场16批鬼箭羽ITS2序列分析，发现其种内保守性高，种内变异率低，具有较高的遗传稳定性，可以将非变异材料的ITS2序列作为对照序列来鉴定正品鬼箭羽。此外，从K2P遗传距离可以看出，本研究16批鬼箭羽样品与其近源种的种内种间遗传距离远小于与其混伪品的遗传距离，在NJ系统聚类树上也可以看到16批鬼箭羽与其近源种成一个大分支，混伪品自成一支，其中，以往被作为鬼箭羽入药的栓翅卫矛与卫矛聚为不同的支，而卫矛与16批鬼箭羽样品聚为一支，能够明显区分，可为后续研究提供参考。