一种新型ICG递送纳米颗粒的制备及其在肿瘤成像中的应用＊

范秀松 刘 朋 言伟强,*

1.北京大学深圳医院医学影像科 (广东 深圳 518035)

2.北京大学深圳医院骨科生物材料国家地方联合研究中心 (广东 深圳 518036)

1 前 言

吲哚菁绿(ICG)是一种生物相容性良好的近红外荧光染料，可应用于肿瘤成像诊断和光热治疗等多个领域[1-2]。虽然ICG已被美国药物管理局(FDA)批准用于临床近红外成像，然而其在体内的半衰期仅有150到180秒，很容易被分解代谢，从而导致其在肿瘤部位蓄积时间短，限制了其广泛的应用。

近年来随着纳米科技的飞速发展，纳米药物递送体系受到了广泛的关注。纳米材料可以延长血液循环时间和通过增强渗透和保留(EPR)效应提高其在肿瘤部位的蓄积，实现对肿瘤的被动靶向[3-5]。一系列的纳米颗粒(聚合物、四氧化三铁[6]、介孔硅颗粒[7]、石墨烯[8]等)已被开发用于药物的有效递送、提高肿瘤部位的蓄积，其中聚合物纳米颗粒由于其制备简单、易修饰、生物相容性好等优势而被广泛用于药物的递送[9]。因此，通过构建ICG递送纳米颗粒可克服其半衰期短、肿瘤部位蓄积少的缺点，促进ICG的广泛应用。

通过静电作用构建药物递送纳米颗粒是一种绿色安全的方法，制备过程完全在水相中进行，无需有机溶剂的参与，具有广阔的应用前景[10-11]。由于ICG分子带有两个磺酸基分子，因此其成负电性。基于此，我们通过制备了一种带阳离子的两嵌段聚合物利用静电相互作用构建了一种聚合物递送ICG纳米颗粒，用于实现ICG的有效递送和肿瘤荧光成像。考察了ICG纳米颗粒的尺寸、生物相容性以及在肿瘤部位的蓄积和成像效果。

2 资料和方法

2.1 基本资料

聚甲基丙烯酸聚乙二醇单甲醚 (PPEGMA,Mn=500)，4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸(CDTPA)，偶氮二异丁腈(AIBN)，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA) 和二氧六环购买自于Sigma-Aldrich。2-(2'，3'，5'-三碘苯甲酰基)甲基丙烯酸乙酯(TIBMA)按照文献的方法合成[12]。

2.2 PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)的合成

将 PEGMA(2.41 g) 溶解在二氧六环 (5mL) 中，然后将 AIBN (7.9mg) 和CDTPA(97.2mg) 加到该溶液中。 将该混合物鼓氩气30 分钟除氧，并在70℃下搅拌聚合24小时。 将反应液倒入过量的冰乙醚中，通过离心收集沉淀物并真空干燥获得PPEGMA大分子转移剂。

将PPEGMA-CDTPA (0.5g)、DMAEMA (0.55g) 、TIBMA(0.92g)和 AIBN (3.28mg) 溶解在二氧六环 (4mL) 中。将该混合液鼓氩气30分钟除氧，并在70℃下搅拌聚合24小时。 将反应液倒入大量过量的乙醚中，通过离心收集沉淀物并真空干燥获得PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)。

2.3 ICG负载 纳米颗粒的制备及表征

将5mg PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)溶于水中，然后在搅拌状态下将1mg吲哚菁绿(ICG水溶液)滴入，室温搅拌1h，放入3500透析袋中透析1天，收集放在4度冰箱储藏待用。纳米颗粒的粒径及粒径分布用动态光散射来测定。

2.4 ICG纳米颗粒的生物相容性测试

通过MTT法测定ICG纳米颗粒对U87(人神经胶质瘤细胞)的细胞毒性。，将U87细胞以5×103个细胞/孔接种于96孔板中，使用100μL含10% FBS的DMEM培养基，37℃培养过夜。将每孔中的培养基更换为相同体积的含有不同浓度的 ICG纳米颗粒DMEM培养基，并且孵育24小时。之后，将每孔中的培养基更换为100μL含有浓度为0.5mg/mL的MTT的DMEM培养基，并将细胞在37℃下再培养4小时。4小时后，将含 MTT 的培养基替换为100μL DMSO，在酶标仪上记录每个孔在 595nm 处的吸光度。数据表示为()。 (n=3)。

2.5 ICG纳米颗粒与U87细胞的相互作用

将U87细胞接种在 4 孔Lab-Tek分室盖玻片中(每孔5×105个细胞)，使用0.5mL含10%FBS的DMEM培养基孵育过夜。然后去除培养基，加入含有ICG或ICG纳米颗粒的培养基在37℃培养4h，去除培养基，用 PBS洗涤细胞三次并用4%多聚甲醛溶液固定细胞15分钟。采用DAPI进行细胞核染色，并使用共聚焦显微镜观察。

2.6 ICG纳米颗粒在荷瘤裸鼠中的分布

通过将U87细胞(1×106个细胞)注射到裸鼠的右侧，获得荷瘤小鼠。 待肿瘤体积增长到大约 60mm3后，将小鼠随机分为2组，每组6只。ICG或ICG纳米颗粒通过尾静脉注射 到小鼠体内。 在不同时间点通过小动物荧光活体成像观察 其在荷瘤小鼠体内的分布。

3 讨 论

3.1 PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)的合成

PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合的方法制备，其合成路线图如图1所示。首先以CDTPA为链转移剂将PEGMA通过RAFT聚合制备了大分子链转移剂PPEGMA，然后以PPEGMA为大分子链转移剂将DMAEMA和TIBMA共聚得到两嵌段聚合物PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)。

图1 PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)的合成示意图。图2 PPEGMA 和PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)在氘代氯仿中的1H-NMR图。图3 PPEGMA 和PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)的GPC图，流动相为THF。图4 ICG纳米颗粒的粒径分布图。图5 ICG纳米颗粒的生物相容性。图6 ICG纳米颗粒的内吞图。图7 ICG纳米颗粒在荷瘤裸鼠的体内分布

通过凝胶渗透色谱(GPC)和1H-NMR 证明了PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)的成功合成。在图2中可以明显的可以看到各氢的化学位移峰。通过积分计算得PPEGMA-b-P(DMAEMAco-TIBMA)中PPEGMA、DMAEMA和TIBMA的聚合度分别为10、41和16。利用 1H-NMR 和GPC计算所得PPEGMA 和PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)的分子量如表1所示。

表1 各聚合物的分子量(g/mol)

3.2 ICG纳米颗粒的制备及表征

PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)在水溶液中由于DMAEMA而带正电，ICG则因带有磺酸基而带负电，因此，在水溶液中通过将 PPEGMA-b-P(DMAEMAco-TIBMA) 和 ICG混合，则可以通过静电相互作用获得 ICG纳米颗粒，其中PPEMGA位于纳米颗粒的表面，降低其在血液循环中的蛋白吸附，延长血液循环时间；带负电的ICG和带正电的P(DMAEMA-co-TIBMA)段形成纳米颗粒的内核。通过动态光散射测得ICG 纳米颗粒的直径为55nm。

3.3 ICG纳米颗粒的体外表征

良好的生物相容性是纳米颗粒用于体内成像的首要条件，因此，我们利用MTT 法测定ICG纳米颗粒对 U87细胞的毒性，结果表明，ICG纳米颗粒具有良好的生物相容性，在测试浓度范围内不会影响U87细胞的存活率。

此外，本研究还考察了ICG纳米颗粒与U87细胞的相互作用。通过将ICG纳米颗粒和U87细胞共孵育3 h，然后利用共聚焦显微镜观察了ICG在细胞内的分布，实验结果表明，ICG纳米颗粒可以更好的递送ICG到U87细胞里面，并且其主要分布在细胞质中。

3.4 ICG纳米颗粒的体内肿瘤成像

本研究通过小动物荧光成像考察了ICG纳米颗粒在荷瘤小鼠体内的分布及在肿瘤部位的蓄积。结果表明，经过尾静脉注射24 h后，ICG纳米颗粒可以递送ICG到肿瘤部位，实现肿瘤的荧光成像，而单独的ICG则已经快速从体内代谢。

4 结 论

本研究利用简单的静电相互作用构建了一种聚合物ICG纳米颗粒，该纳米颗粒的水和粒径为55 nm。该纳米颗粒具有良好的生物相容性，并且可快速进入U87细胞内部，分散在细胞质中。此外，ICG纳米颗粒可以在活体肿瘤部位有效的蓄积实现肿瘤的荧光成像。