微生物有机肥对芋头产量品质性状及土壤微生物类群的影响

郭巨先，李桂花，符 梅，刘县明，罗文龙，骆善伟，刘玉涛

（1广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广州 510640；2韶关甜宝农业开发有限公司，广东韶关 5125002；3广州国家现代农业产业科技创新中心，广州 510520）

0 引言

芋头[Colocasia esculenta(L.)Schott]，俗称芋艿，或毛芋，原产于中国、马来西亚、印度等国家，是一种粮菜兼用的作物，具有较高的食疗和医疗价值，同时具有多种生物活性、抗氧化，以及降低胆固醇和血糖、提高免疫力等作用[1-2]。中国是世界芋头主产国之一。据联合国粮农组织统计，到2019年，中国芋头收获面积达到9.85万hm2，产量1954.8万t，世界芋头品种有700多个，中国有400多个品种[3]。随着粤港澳大湾区“菜篮子工程”的建设，芋头作为市场流通的主要大宗农副产品之一，芋头已被列为拟开发的14种特色蔬菜之一[4]，可见芋头在蔬菜中的地位越来越高。在中国芋头种植区域主要以珠江流域和台湾为主，长江及淮河流域次之。‘炭步槟榔香芋’是广东省广州市花都区炭步镇的特产之一，具有个头大、淀粉含量较高、有粉而香的优点[5-7]。2014年，‘炭步槟榔香芋’已入选国家农产品地理标志保产品目录，远销香港、澳门、新加坡、新西兰、加拿大等地[4]。随着科技的迅速发展，芋头的栽培技术也在不断提高。其中，基肥和膨大肥是芋头种植过程中两个最重要的施肥环节，对芋头植株生长发育及其最终产量影响至关重要。已有研究表明，施加有机肥能显著增加芋头单株子芋产量和数量[8]。近年来，微生物有机肥已得到逐渐重视。微生物有机肥的使用可明显减少化肥施用量，降低环境污染，并且通过微生物与植物根系间的互作加速植物对养分的吸收和转化，进而提高蔬菜产量和抗病能力[9-11]。研究表明，施用光合细菌有机肥不仅能够显著增加番茄的株高、地径和品质，还可有效调节土壤的pH，促进园艺作物对土壤中速效氮磷钾的吸收，改良土壤中有机质含量[12]。微生物有机肥可有效改善土壤结构，并且优化土壤微生物菌群。随着测序技术和生物信息学的迅猛发展，微生物组学已被广泛应用到土壤微生物菌群分布和根际微环境生物学效应中来。微生物多样性研究主要针对于编码核糖体RNA的核酸序列保守区进行分析的。王涛等[13]的研究发现，施加微生物有机肥可有效缓解黄瓜连作问题，且能有效优化连作土壤微生物菌群分布，改善连作土壤理化特性，进而提高土壤酶活性。微生物有机肥可缓解设施菜地因单一的种植方式或者过量施肥而导致的土壤板结等问题。马慧媛等[14]的研究表明，施用微生物菌肥可改善设施茄子土壤营养状况，大幅增加土壤微生物数量，进而促进茄子营养生长，增加茄子的最终产量。高逸等[15]的研究表明，在设施生菜施用微生物有机肥后，可富集有益菌种类，改变土壤微生物比例，降低生菜发病率，提高生菜产量。然而，微生物有机肥对芋头产量品质以及土壤菌群的影响仍缺少系统研究。为此，本试验以‘炭步槟榔香芋’为材料，研究不同微生物有机肥效应以及几种施肥模式对香芋品质和产量的影响，并利用微生物组学方法，分析微生物有机肥对土壤根际微生物种群的影响，并尝试提出微生物有机肥通过根际微生物互作提高芋头品质性状的分子机制，以期为芋头提质节本增效栽培技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本试验在广东省韶关市始兴县罗坝镇上营村芋头种植示范基地进行，东经24.8533°，北纬114.1533°，海拔190 m，年降水量1825 mm，年平均气温19.6℃，无霜期296天，属热带亚热带季风气候。沙壤土，肥力中等，地势平坦。土壤pH 6.97，有机质29.9 g/kg，碱解氮134.01mg/kg，有效磷98.03mg/kg，速效钾124.05mg/kg。

1.2 试验材料

试验芋头品种为‘炭步槟榔香芋’，微生物有机肥由广东省微生物研究所提供（芽孢杆菌有效活菌数＞2亿/g，含有约40%烟沫，有机质＞60%）。硫酸钾肥（K2O含量50%）和发酵腐熟的花生麸有机肥购于始兴县顿镇镇顺景农资经营部（有机质＞45%）。

1.3 试验方法

试验于2020年2月25日整地施基肥起垄。3月2日栽植芋头，栽培密度为40 cm×40 cm，单垄种植，4月17日（发棵期）和6月17日（膨大期）分别追肥2次。试验设计4个施肥处理（表1），T1：微生物有机肥基肥+复合肥+硫酸钾=3750 kg/hm2+675 kg/hm2+75 kg/hm2；T2：微生物有机肥基肥+复合肥+硫酸钾=3750 kg/hm2+675 kg/hm2+112.5 kg/hm2；T3：微生物有机肥基肥+复合肥+硫酸钾=3750 kg/hm2+675 kg/hm2+150 kg/hm2；对照(CK)：发酵腐熟的花生麸基肥+复合肥+硫酸钾=3750 kg/hm2+675 kg/hm2+75 kg/hm2。每个处理重复3次，每个重复种1畦地(30 m2)。12月28日测定母芋、子芋重等芋头产量指标，同时取芋头鲜样分成两部分，一部分鲜样测定相关抗氧化物活性或含量以及Vc，一部分鲜样烘干后测定芋头总糖、总酚、总黄酮、直链淀粉、支链淀粉和粗纤维等芋头的营养指标。同时采用五点采样法，取处理T1和CK的根际土壤样品放-80℃冰箱，测定土壤微生物多样性。

表1 香芋种植的施肥方案 kg/hm2

1.4 抗氧化物酶活性和营养成分检测方法

丙二醛(MDA)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的测定均采用试剂盒测定方法（索莱宝试剂盒）；抗坏血酸(Vc)的含量测定采用2,6-二氯靛酚滴定法(GB/T 5009.86—2016)；采用酸水解苯酚-硫酸比色法测总糖含量(GB/T 15672—2009)；福林酚比色法测定总酚的含量(GB/T 15672—2009)；硝酸铝盐比色法测定总黄酮[16]；利用双波长比色法测定芋头的直链淀粉和支链淀粉含量[17]；利用范式洗涤法测定芋头的粗纤维含量[18]；全氮的含量采用凯氏定氮法测定，全磷的含量采用钼锑抗比色法测定，全钾含量测定采用火焰光度法测定[19]。

1.5 土壤微生物组学分析

为比较基肥期施加微生物有机肥的效应，我们在12月28日提取土壤样品（约1 g），测定土壤微生物组学。处理组和对照组CK各6次生物学重复。样品收集后液氮冷冻保存，采用Trizol法提取样品DNA，并通过Illumina Hiseq2500 PE250测序仪进行测序[15]。首先，使用Trimmomatic v0.32软件对微生物组学测序得到的raw reads进行过滤；然后利用cutadapt 1.9.1软件对引物序列进行识别和去除，获得无引物序列的高质量Reads。使用FLASH v1.2.7软件，对每个样本的高质量Reads进行重叠拼接。然后使用UCHIME v4.2软件，识别并去除嵌合体序列以获得最终的有效数据。基于OTUs和ASVs等特征的分析结果，对样本进行分类分析，得到各样本在门、纲、目、科、属信息，构建系统发育树和分类树状图。以Alpha多样性为参数，分析微生物有机肥处理下的物种多样性程度，并统计每个样品的Ace、Chao1、Shannon和Simpson指数，绘制样品稀释曲线和等级丰度曲线。最后通过功能预测分析样本中的基因功能或表型预测并计算功能基因或者表型丰度。

2 结果与分析

2.1 不同微生物有机肥施肥方式对香芋产量的影响

如表2所示，相对于对照(CK)，T1～T3对‘炭步槟榔香芋’的单株母芋和子芋的质量无显著影响；各处理在田间可收获健康芋头的比例在80.2%～96.0%，产量在15436～21392 kg/hm2，T1～T3的产量极显著大于对照，说明微生物有机肥能显著提高芋头的田间抗病性；另外，追肥期间增加硫酸钾肥对母芋和子芋重均无显著影响，对子芋和母芋密度也无显著影响，说明基肥期间，施加适量微生物有机肥对芋头的经济产量具有重要促进作用。

表2 不同施肥方式对香芋产量的影响

2.2 不同微生物有机肥施肥方式对香芋营养品质的影响

各处理的‘炭步槟榔香芋’营养品质结果如表3所示。相对于CK，T1～T3处理对Vc、总酚、直链淀粉和粗纤维均有不同程度的促进作用。其中，T1和T3的Vc含量显著高于CK；T1～T3总酚含量和粗纤维含量随着硫酸钾肥量增加而增加，与CK差异显著，总酚含量比对照上升幅度为12.4%～27.0%，粗纤维含量比对照增加20.1%～38.8%；直链淀粉含量比对照增加8.8%～33.7%。T1～T3各处理对总糖、总黄酮和支链淀粉含量无显著影响，甚至对于总糖和支链淀粉含量略有降低趋势。因此，施加微生物有机肥和适量的硫酸钾肥可有效提高芋头的总酚、直链淀粉和粗纤维的含量。

表3 不同施肥方式对香芋母芋营养品质的影响

2.3 不同微生物有机肥施肥方式对香芋活性物质的影响

各处理对‘炭步槟榔香芋’活性物质的影响结果如表4所示。相对于CK，各处理仅在一定程度上提高抗氧化活性，SOD活性、CAT活性和MDA含量都呈降—升—降趋势，POD活性呈先升后降的趋势。其中T1的POD活性最高，达到603.75 U/(g FW)，比CK增加48.4%；T2的SOD活性、CAT活性和MDA含量最高，比CK分别增加118.0%、19.0%和58.8%。这些结果表明施加微生物有机肥和增加一定量的硫酸钾肥有利于提高抗氧化物酶活性，提高芋头植株的抗性。

表4 不同施肥方式对香芋活性物质的影响

2.4 不同微生物有机肥施肥方式对香芋矿质元素的影响

各处理对香芋矿质元素含量如表5所示。各处理的全N含量呈降—升—降的趋势，全P含量呈先升后降趋势，全K含量呈先降后升的趋势。T2的全N和全P的含量最高，分别达到18.75 g/kg和2.82 g/kg，比CK增加13.4%和61.1%，较CK差异显著。T3的全K含量最高，达到17.99 g/kg，比CK增加29.3%，较CK差异显著。这些结果说明施加微生物有机肥加适量硫酸钾肥有利于促进芋头根茎中氮、磷和钾元素的提高。

表5 不同施肥方式对香芋矿质元素的影响g/kg DW

2.5 土壤微生物组学分析

为探究是否土壤微生物菌群会对炭步槟榔香芋根茎磷钾含量的促进作用有影响，本文进一步展开了土壤微生物组学分析。其中，从12个生物样品测序中，一共获得957427对RawReads，经过双端Reads质控、拼接后共产生950340条Clean Reads，8个样品中，每个样品至少产生76273条Clean Reads，平均产生79195条Clean Read（s表6）。

表6 样品测序数据处理结果统计

Alpha多样性反映了单个样本的物种丰富度和多样性，有多个指标：Chao1、Ace、Shannon、Simpson 和Coverage。Chao1和Ace指数衡量物种丰度，即物种数量。Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性，并受样本群落中物种丰度和群落均匀度的影响。如表7所示，施加微生物有机肥并不会显著增加Chao1、Ace、Shannon、Simpson的指标，对于土壤微生物多样性影响不大。

表7 Alpha多样性指数统计

通过比较微生物有机肥处理下微生物物种的分布，表明微生物有机肥处理下，芽孢杆菌(Bacillus)、魏氏杆菌(Weissella)和念珠菌嗜酸杆菌(candidatussolibacterium)的丰度显著高于CK组（图1）。而根癌杆菌和乳酸菌丰度显著降低，说明微生物有机肥可有效改变土壤微生物种群的分布，对于根际微环境及根系土壤互作有重要影响。

图1 生物菌肥处理与对照比较下土壤微生物中物种（属）分布图

COG(Clusters of Orthologous Groups of protein)是原核生物同源蛋白簇数据库，是原核生物常用的蛋白质功能分类数据库。COG的功能预测分析方法与KEGG基本相同，分析结果表明（图2），相对于CK，生物菌肥处理后，可有效增加核苷酸代谢、DNA重组、复制和修复效率，提高蛋白翻译效率，优化核糖体结构，进而加速细胞分裂和染色质重组，有利于芋头氨基酸代谢和产量的累积。相反，微生物有机肥处理降低了信号转导代谢（图2）。

图2 组间COG功能差异分类统计图

3 结论与讨论

芋头是中国重要的经济作物之一，对于提高农民收入起到重要的作用。由于芋头在生产上以无性繁殖为主，长期以来农民种植的芋头种苗都是茬地自留种，加上芋头生长周期长达10～12个月，因此连作问题十分严峻。传统的茬地育苗方式导致芋头种苗携带病原菌，抗性减弱、品质变劣。长期的连作栽培措施导致土壤板结以及土壤有害微生物数量增加，农民种植芋头病害发生严重。尤其是近几年，广东省芋头发病率高达到80%以上，福建宁德管理不当的田块发病率甚至达到95%[7,20]，严重限制了芋头的产业化发展。因此，本研究围绕特色芋头生产中提质增效的关键技术问题，探索了微生物有机肥对于改良土壤特性，优化土壤微生物种群，进而提高芋头经济产量和品质性状的效应机制。

3.1 微生物有机肥对芋头产量品质相关性状的影响

微生物有机肥中含有大量的高活性细菌，在发酵过程中会产生各种有利于植物生长的代谢物，如赤霉素(GA)、细胞分裂素(CTK)和吲哚乙酸(IAA)等。还可以产生各种维生素、氨基酸和各种有机酸等，这些代谢物可调节植物的生长发育。同时，细菌还可以直接作用于植物的根部，进而对于植物的生长发育起到调节作用[21-22]。本研究也证明通过基肥施加微生物有机肥，追肥增加硫酸钾肥可有效减少炭步槟榔香芋子芋质量和提高母芋质量，同时提高健康芋头的比率高达14.8%～15.8%，说明施加微生物有机肥对炭步槟榔香芋的经济产量具有重要作用。与本研究报道相似，肖树涛等[23-24]的研究表明，施用微生物有机肥可显著提高小麦叶片数、株高、分蘖数、产量和品质。马惠元等[14]的研究还表明，向茄子施用微生物有机肥可以改善土壤营养状况，增加土壤微生物数量，从而促进茄子的营养生长，有利于茄子的经济产量提高。另外，由于基肥和膨大肥对芋头植株生长发育尤其后期影响至关重要[14]。已有研究表明，在基肥和膨大肥中施加适量有机肥可显著增加芋头单株子芋产量和数量[8]。本研究表明微生物有机肥和复合肥的配合施用也能对芋头产量提高起到促进作用。

另外，本研究也表明施加微生物有机肥可提高芋头的品质性状，包括Vc、总酚、总黄酮、直链淀粉、粗纤维以及芋头的N、P、K的含量（表3、5）。当追施硫酸钾肥112.5～150 kg/hm2时，芋头的N、P、K的含量都显著高于CK。田俊岭等[25]研究也证实，在烟草中施用微生物有机肥后，可大幅度提高烟草的硝酸还原酶活性，成熟期烟叶蛋白质含量显著降低，烟叶品质提高，烟叶游离脯氨酸含量、成熟时色素、根、茎、叶等器官钾含量可显著增加。

使用微生物有机肥可同时减少化肥施用量，降低环境污染程度，通过微生物与植物的相互作用，加速植物对养分的吸收利用，从而提高蔬菜产量和抗病抗逆能力[9-11]。本研究发现施加微生物有机肥配合硫酸钾肥112.5 kg/hm2可对SOD酶活性、CAT酶活性和MDA酶活性有显著的提高作用，同时MDA的含量也达到最高（表4）。这些结果说明微生物有机肥对芋头的抗氧化物活性的影响因素较复杂。

3.2 微生物菌肥对土壤微生物菌群的影响

作为土壤养分和能量的“源”和“库”，土壤微生物在维持不同的生态系统功能和碳氮循环方面发挥着关键作用[26-27]。土壤养分的多样性导致土壤碳源的复杂多样化[28]，土壤微生物也是各种碳源降解的关键驱动力[29]。微生物功能多样性在保证生态平衡中的作用机制尚缺乏研究。本研究分析了施加微生物有机肥条件下土壤微生物菌群变化趋势，发现了该处理并不会显著提高微生物菌群多样性。以Alpha、Chao1、Shannon和Simpson指数为例[30]，微生物有机肥的促进效应不足4%（表7），这可能与施氮肥的微生物多样性的效应有较大差异，也可能由于微生物有机肥处理后有机物归还到土壤中的数量明显提升，进而导致微生物功能多样性相似的主要原因[31-32]。

芽孢杆菌(Bacillus)和黄杆菌属(Flavobacterium)是植物根际促生菌的两大类型[32]。芽孢杆菌具有存活期长、抗逆性强的特点，广泛分布于不同土壤和植物根际，有的还可侵入植物组织内部。该属中的许多菌株因其高效的固氮能力、对病原菌的极强抵抗力以及对植物的生长促进作用而受到研究人员的广泛关注[33-34]。值得注意的是，本研究中微生物有机肥处理下，芽孢杆菌(Bacillus)、魏氏杆菌(Weissella)和念珠菌嗜酸杆菌(candidatussolibacterium)的丰度增加显著（图1）。这些菌株的固氮能力及促生能力可能有效提高植物自身的核苷酸代谢以及蛋白翻译效率，有利于增加芋头的抗逆能力提高氨基酸代谢和经济产量（图2）。与此报道类似，施入微生物有机肥有利于改善土壤的微生物分布模式，明显增加土壤细菌和放线菌的数量，但可能会降低真菌的数量[35]，说明微生物有机肥可改变土壤细菌和真菌比例，刺激植物例如小麦的核苷酸和氨基酸代谢效率，进而可能提高植物免疫应答能力[24]。

综上，微生物有机肥是一种以高产、优质、环保为目标的绿色肥料。既能提高芋头的经济产量和品质，又能提高土壤肥力，可增加土壤中芽孢杆菌等微生物菌群丰度，进而有效提高农田综合生产力，为我国绿色农业持续稳定发展提供有效保障。