中医药抑制脑出血后铁死亡的研究进展*

王天琪,邹伟

1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040; 2.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040

脑出血指非外伤性脑实质内出血,是脑卒中的一个亚型,以老年患者居多。脑出血具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点,给社会和患者家庭带来了沉重的负担[1]。在全球范围内,每年新发脑出血病例约200万,且呈逐年上升的趋势,预计2050年该病的发病率将翻倍[2]。虽然脑出血的发病率仅占脑卒中疾病的26.7%～51.5%,但它比脑梗死的预后更为严重,多数患者受到不同程度的残疾的困扰,且该病30天内的死亡率高达20%～40%[3]。脑出血后,除血肿机械占位等原发损伤外,血肿周围出现的脑水肿、缺血缺氧等继发性损伤亦是影响患者长期预后的主要因素。目前,西医疗法虽见效快,但仍存在手术导致的再出血、感染、神经损伤等风险。中医药具有多途径、多靶点的优势,体内、体外实验均已证实其在治疗疑难杂症方面的独特作用。近年来,铁死亡作为一种新型细胞死亡形式受到了医学领域的广泛关注。中医药能够通过干预铁死亡核心分子的上下游环节实现对受损神经细胞空间构象与功能障碍的调节。现有研究围绕脑出血后神经细胞出现的铁沉积、氧化应激、内质网应激、线粒体功能障碍等开展了大量中医药抗铁死亡的作用机制研究[4-5],中医药调节铁死亡已成为脑出血治疗的新方向。本文以铁死亡为切入口,简述其发生机制及中医药对脑出血后铁死亡的干预机制,以期为进一步提高中医药治疗脑出血的疗效提供思路。

1 铁死亡概述

铁死亡的概念于10年前由Dixon等[6]提出,是因细胞内铁过载而发生的一种新型程序性细胞死亡方式,主要损害细胞的抗氧化能力,使得脂质过氧化从而导致死亡。铁死亡与坏死、凋亡等其他细胞死亡形式在细胞形态、生化特征、遗传特征方面存在显著差异[6]:在细胞形态上,主要表现为线粒体体积缩小、膜密度增大、嵴减少或消失、密度增大、外膜破裂,但细胞核正常[7];在生化特征上,表现为细胞内具有抗氧化作用的谷胱甘肽合成减少或耗竭[6],致使过氧化物分解酶谷胱甘肽过氧化物酶4活性下降甚至失活,影响氧化还原反应,病理性铁积累可通过芬顿反应产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),与细胞膜上的多不饱和脂肪酸发生氧化应激反应,促进毒性脂质过氧化物的聚积,诱导细胞氧化性损伤,导致细胞铁死亡[8];在遗传特征上,铁死亡是由铁代谢、脂质合成和氧化应激途径相关的基因调控的生物学过程[9]。

2 铁死亡的发生机制

铁死亡的发生与细胞内脂质过氧化和铁代谢紊乱有关,下文将就这两方面简要归纳铁死亡的发生发展以及脑出血发生后的主要变化。

2.1 脂质过氧化脂质过氧化的发生主要是因为磷脂膜上含有易受过氧化作用影响的碳原子的脂质,如多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA),在相邻的C=C双键之间存在异常弱的 C-H 键,过氧基(O-O)取代附着在碳原子上的氢原子,最终导致细胞铁死亡[10]。PUFA特别是含有花生四烯酸(arachidonic acid,AA)或其衍生物肾上腺素的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)[11]的脂质过氧化驱动细胞走向铁死亡,酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-CoA ligase 4,ACSL4)和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)参与 PE的生物合成和重塑,能催化PUFA酯化,激活PUFA,并影响PUFA的跨膜特性,进而增加细胞铁死亡敏感性,随后在脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)的催化下进一步氧化生成对铁死亡具有促进作用的多不饱和脂肪酸磷脂氢过氧化物(PUFA-PL-OOH)[10]。目前,在人类和小鼠脑出血后均可观察到LOX和脂质过氧化物的增加[12]。广泛的脂质过氧化及PUFA耗竭的恶性连锁反应改变了细胞膜的稳定性,具有毒性的脂质过氧化物引起蛋白质等分子失活是铁死亡的直接驱动因素。

system Xc-/GSH/GPX4所在的通路被看作是铁死亡脂质过氧化级联反应中的上游事件[13],是细胞内重要的抗氧化系统。system Xc-是细胞膜上的胱氨酸/谷氨酸逆向转运体,由两个亚基SLC7A11、SLC3A2组成,可介导细胞内外谷氨酸与胱氨酸进行11交换[14],胱氨酸进入细胞后被还原为半胱氨酸(cysteine,Cys),与谷氨酸共同用于合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)。GSH是一种具有清除氧自由基作用的抗氧化剂,由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸构成[15]。谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione Peroxidase 4,GPX4)是谷胱甘肽过氧化物酶家族的一位重要成员,在自由基和重金属的刺激下,在GSH作为辅酶的作用下可将具有活性的PUFA-PL-OOH还原为不具有活性和致命性的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)[10],从而抑制细胞铁死亡。由此可见,当system Xc-被抑制后,细胞内GSH合成减少,GPX4活性降低,脂质过氧化物PUFA-PL-OOH大量累积,为细胞发生铁死亡创造了物质基础。除此之外,在过去的几年里,已经发现了3种独立于system Xc-/GSH/GPX4的抑制铁死亡的系统。铁死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)/辅酶Q10(CoQ10)、二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotate dehydrogenases,DHODH)、GTP环化水解酶1(GTP cyclohydrolase 1,Gch1)/四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)均可对铁死亡中脂质过氧化物积累过程进行调节[10]。

脑出血后,神经细胞外谷氨酸表达水平明显升高,system Xc-对细胞外谷氨酸的浓度异常敏感,使得其转运谷氨酸的作用明显受限,胞内谷氨酸摄取减少,GSH合成受抑制,细胞抗氧化防御受到影响,造成脂质活性氧积累而引发铁死亡[16]。Zhang等[17]发现大鼠在脑出血后的24 h,脑内GPX4达到最低水平,并检测出GPX4下降主要发生在神经细胞中,此时神经细胞的抗氧化能力已明显降低。现有证据表明,铁螯合剂可显著改善脑出血小鼠的脑损伤[17],并对脑出血后继发性出血有抑制作用,进一步证实了铁死亡在脑出血后继发性神经细胞损伤中的潜在调节作用。同时,谷氨酸亦具有神经递质作用,谷氨酸水平过高会导致谷氨酸受体过度刺激,导致兴奋性毒性和神经细胞死亡。另外,谷氨酸的浓度还与脑出血的残腔体积和不良的神经功能有关。因此,如何降低细胞外谷氨酸的积累、调节谷氨酸代谢以及提高细胞内的抗氧化能力是减轻铁死亡的又一关键环节。

2.2 铁代谢细胞铁代谢是一个复杂过程,胞内铁含量的变化依赖于铁的吸收、排泄、利用和储存之间的动态平衡,铁代谢紊乱会影响其他代谢过程进而导致疾病的发生。生理状态下,细胞外Fe3+可以直接与转铁蛋白(transferrin,TF)以21的比例结合,而Fe2+必须氧化成Fe3+才能与TF结合[18],细胞膜上的转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TFR1)对含Fe3+的TF具有较高的亲和力,Fe3+、TF、TFR1三者结合后以胞吞形式入胞[19],随后金属还原酶3将Fe3+还原为Fe2+,然后在二价金属离子转运体和锌-铁调节蛋白家族8/14(ZIP8/14)的作用下,脱蛋白被释放至胞质中[20],储存在不稳定铁池(labile iron pool,LIP)内,或被氧化成Fe3+储存于铁蛋白中,以防Fe2+引起氧化应激,避免细胞损伤或死亡[21-22]。当铁稳态失衡时,过量的Fe2+可催化芬顿反应,产生具有较强毒性的羟基自由基,并与磷脂细胞膜上的PUFA共同启动脂质过氧化链式反应,使细胞内脂质活性氧浓度增加,对胞膜的完整性、稳定性造成威胁[23-24],诱导铁死亡。

线粒体铁蛋白(mitochondrial ferritin,FtMt)是一种线粒体铁储存蛋白,其表达具有组织特异性,在代谢活动度高的细胞中呈现高表达,如睾丸、大脑等[25]。研究发现,FtMt主要表达于神经元,而非胶质细胞[26]。此外,FtMt可以调节异常的铁代谢,从而减少ROS的产生和积累,显著抑制铁死亡的发生[27]。

铁自噬由Mancias等[28]于2014年首次提出,是一种通过溶酶体降解铁蛋白释放游离铁来调控细胞内铁含量的选择性自噬方式。适度铁自噬可以帮助细胞保持铁含量稳定,但是过度的铁自噬使溶酶体受损,释放出大量游离铁并在芬顿反应下产生大量的ROS,诱导脂质过氧化,使细胞发生铁死亡[29]。在缺铁条件下,核受体共激活因子4结合铁蛋白将其递送至自噬体内,在自噬体中,铁蛋白经溶酶体降解后,铁被释放并输出至细胞质增加LIP,进而催化芬顿反应,导致ROS积累,促进铁死亡[30]。

脑出血发生后,红细胞破裂,产生大量血红蛋白,血红蛋白分解产生含铁血红素和珠蛋白,其中的含铁血红素通过与血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)反应,进一步裂解生成游离铁,进而使出血部位Fe2+积累,通过参与炎症反应诱导氧化应激和芬顿反应,促进lipid-ROS生成,破坏了细胞氧化平衡,导致铁死亡发生[31]。此外,Fe2+通过催化芬顿反应生成的水会直接加重出血部位水肿;而生成的羟基自由基会攻击脑细胞膜磷脂中的多聚不饱和脂肪酸,发生脂质过氧化反应,导致机体Ca2+-Mg2+-ATP酶等失活,进而造成离子运转障碍,导致血脑屏障结构受损,血管通透性增加而加重出血部位水肿[32]。然而又有研究指出,HO-1在铁代谢中既是铁死亡的抑制剂又是促进剂[33],一方面,当ROS被清除时,HO-1被中度激活,通过降解游离铁和胆绿素发挥细胞保护作用,防止细胞衰老;另一方面,当HO-1被高度激活时,通过积累更多的铁和产生更多的ROS发挥促氧化作用,从而加速铁死亡的进程。因此,铁过载诱导的铁死亡以及后续发生的抗氧化剂消耗,可能也是脑出血后脑损伤的一个重要机制。

3 中医药抑制脑出血后铁死亡研究现状

目前,中医药已广泛应用于脑出血治疗全程。通过分析脑出血的病因病机,探究铁死亡典型特征所蕴含的中医学内涵,构建神经细胞铁死亡与脑出血病因病机的内在关联,更有利于探究中医药精准干预脑出血后的铁死亡环节。

3.1 从中医病机理论探讨脑出血后铁死亡的机制脑出血可归属于中医“中风中脏腑闭证阳闭”范畴,其中医核心证候要素为“虚、瘀、痰”。中医理论认为“气血逆乱,上犯于脑”是其病机,本病的证候特征是血溢脑脉之外所引起的脑髓神机受损[34-35]。从中医角度分析铁死亡特征可知,过量的铁与脂质过氧化物沉积均为聚集于脑之脉络的瘀浊实邪。瘀浊附于脑之络脉阻碍气血正常运行,脑络因实邪阻滞出现气滞血瘀或因气血不荣而致因虚致瘀,瘀阻津停,津聚成痰,痰瘀互结,郁而化热,酿生痰热,热伤阴津,更可加重人体阴阳失衡状态,虚、热、痰均可致风,诸邪交织,互为因果。脑出血早期可观察到的 ROS与脑铁沉积均为瘀浊滞络的表现,此为神经细胞处于损伤的初始阶段。随着病情发展,病理产物大量蓄积,在铁的催化下驱动了链式脂质过氧化反应,产生了具有毒性的脂质过氧化产物,则为邪蕴成毒的表现。脑出血患者以虚为本,浊毒久郁,虚实兼夹而致髓虚毒损,加剧脏腑衰惫。因此,基于脑出血病机分析铁死亡的中医学内涵对中医药调节铁死亡具有重要意义,毒性代谢产物对神经系统的致死性作用与瘀浊实邪对脑络、脑髓的损伤机理存在共通性。在日后研究中,可深入挖掘以瘀、痰、湿、毒为代表的瘀浊实邪的生物学基础,为中医药调节脑出血后铁死亡提供证据。

3.2 中医药治疗脑出血后铁死亡近年来,中医药对脑出血后铁死亡的调控机制成为研究热点,学者们致力于运用中医药疗法对抗机体的脂质过氧化损伤,纠正铁代谢紊乱,从而抑制细胞铁死亡的发生发展,为中医药治疗脑出血后铁死亡奠定坚实基础。

3.2.1 针对脂质过氧化的治疗Jin等[36]通过体内及体外实验探究了中药提取物丹皮酚对脑出血后铁死亡的作用,发现丹皮酚可通过HOTAIR/UPF1/ACSL4信号通路上调SLC7A11和GPX4的表达,下调ACSL4的表达,降低神经元中ROS和脂质过氧化物MDA的含量,从而达到抑制神经元铁死亡的目的,保护受损脑组织。Yang等[37]观察中药姜黄提取物——姜黄素对小鼠脑出血的影响,结果表明姜黄素可通过调节NRF2/HO-1通路增加GPX4的表达从而控制细胞内脂质过氧化的进程,显著抑制神经细胞的铁死亡。Zhao等[38]研究表明,中药提取物异钩藤碱可通过抑制P53的表达,上调miR-122-5p的表达,促进SLC7A11的转录,从而促进GPX4的表达,降低脂质过氧化常见产物4-HNE的表达,发挥其抗脑出血后铁死亡的作用。研究表明,针刺疗法同样可在脑出血后发挥抑制神经细胞铁死亡的作用,实验过程中观察到针刺后脑出血大鼠脑组织中铁死亡相关的线粒体形态损伤有所减轻,同时,细胞内MDA含量明显减少,可见,针刺能够在神经细胞铁死亡脂质过氧化方面发挥积极作用,抑制铁死亡的发生[39]。Kong等[40]研究发现,针刺疗法可促进GPX4的表达,抑制肿瘤周围区域的铁含量增加,降低ROS及MDA的积累,表明针刺可减轻大鼠脑出血后血肿周围区域的铁死亡,抑制神经元损伤,进而促进神经功能恢复。有证据表明,在脑出血后,头针治疗可通过促进p62/Keap1/Nrf2抗氧化信号通路保护脑组织[41]。Nrf2是氧化应激背景下的关键调节剂,可作为抗氧化剂保护细胞免受铁死亡[42]。Li等[43]探讨了头针疗法能否通过缓解铁死亡减轻小鼠脑出血后出现的继发性损害,并探讨了与该过程相关的病理生理机制,发现头针治疗能够通过触发抗氧化途径 p62/Keap1/Nrf2,并引起GPX4和行使铁蛋白功能的主要亚单位FTH1上调从而促进脑出血后恢复,减轻脑出血后脂质过氧化引起的神经细胞铁死亡。另外,针刺也可以降低家兔脑出血组织脂质过氧化产物含量[44]。Wang等[45]研究了中药藏红花中的有效成分藏红花素对脑出血小鼠的作用,结果表明藏红花素可通过调节Nrf2的表达及核易位上调GPX4、SLC7A11和FTH1的表达,抑制脑出血后细胞内脂质过氧化的过程,最终降低细胞铁死亡发生的概率,从而保护脑组织。Wang等[46]通过网络药理学和动物实验相结合的方法证实蛭龙活血通瘀胶囊可以下调P53表达,促进SLC7A11表达,抑制细胞内脂质过氧化过程,最终抑制大鼠脑出血后铁死亡。上述研究表明,中医药疗法可通过调节对脂质过氧化有直接影响的代谢途径抑制脂质过氧化,减轻细胞内毒性脂质ROS的积聚从而抑制铁死亡。

3.2.2 针对铁代谢异常的治疗杨树升等[47]研究了大承气汤对脑出血大鼠的影响,结果显示,高剂量大承气汤能够通过Nrf2介导的信号通路有效逆转大鼠脑出血后神经功能受损,减少病灶处铁沉积,促进抗炎性因子Arg1释放,并抑制促炎性因子TNF-α释放,从而促进脑出血后脑组织恢复,发挥神经保护作用。蒋士生等[48]构建脑出血大鼠模型观察四妙勇安汤对脑组织内血红素和铁离子代谢的作用,结果表明,作为治疗血管炎名方的四妙勇安汤可以通过调节毛细血管内皮细胞膜蛋白从而降低脑内游离血红素和铁离子含量,以保护神经元、促进神经功能恢复。郭纯等[49]观察了安脑平冲方对脑出血大鼠脑组织铁沉积和病灶周围组织转铁蛋白(Tf)及其受体的影响,实验结果显示该方能够改善脑出血后神经功能受损及铁沉积、Tf、TfR表达升高等不利局面,抑制铁离子向神经细胞内大量转移,减轻氧化应激损伤,从而改善脑出血的预后。研究指出,脑出血急性期大鼠模型病灶脑组织铁沉积量逐渐升高,铁沉积使细胞抗氧化分子GSH和GPX-4耗竭,lipid-ROS累积而诱发神经细胞铁死亡,从而导致继发性脑损伤[50]。黄芩苷是中药黄芩的有效成分,研究发现,经黄芩苷干预后,脑出血小鼠神经细胞损伤程度显著减轻,脑组织内铁离子沉积减少,铁死亡相关基因表达明显改变,表明黄芩苷能够抑制铁死亡,减少神经细胞凋亡[51]。脑泰方可调节脑出血急性期神经细胞铁转运和调节蛋白的表达,提高神经细胞抗氧化分子的含量,从而减轻脑组织铁沉积和神经细胞过氧化损伤,抑制神经细胞铁死亡,发挥脑保护作用[50]。周玉嘉[52]通过临床试验及动物实验证实,具有活血解毒功效的醒脑静注射液能够显著改善脑出血火毒证患者氧化应激状态,促进患者神经功能恢复,同时改善脑出血大鼠神经功能损伤,调节脑出血后脑组织铁离子代谢紊乱,抑制铁死亡的发生。罗贤亮等[53]研究表明,消瘀通腑汤配合穴位针刺可显著提高脑出血患者的临床疗效,改善神经功能缺损程度,提高日常活动能力,对脑组织有较好的保护作用,并可改善机体铁代谢水平。此外,头针治疗能够通过类似于铁螯合剂的方式减少多余的铁,防止脂质过氧化造成的伤害,从而抑制铁死亡,减轻脑出血后神经功能缺损[54-55]。

上述研究表明,中医药疗法不仅可以通过调控脂质过氧化过程抑制铁死亡,还可以通过调节机体内铁代谢、纠正离子紊乱、抑制铁离子积聚、破坏Fenton反应物质基础从而控制铁死亡的进展。

4 讨论

近年来,对中医药调控铁死亡相关信号通路的研究取得了一定的进展,但基于脑出血的研究多局限于动物实验,且多是单独探索中医药疗法对铁死亡通路上某个关键靶点的影响,缺乏大规模、长期随访的临床试验验证,与铁死亡相关的作用机制研究匮乏,且细胞死亡方式相关信号通路及其交互影响有待探讨。今后的研究应继续梳理与总结铁死亡相关信号传导通路,探究脑出血病理过程中与铁死亡相关的信号调节机制,进一步开展与脑出血后铁死亡相关基因表达的鉴定,探索中医药调控铁死亡的机制,挖掘传统中药单体活性成分、复方及针刺、艾灸、推拿等中医适宜技术的关键靶点,为中医药治疗脑出血提供新的思路与策略。