亚甲基蓝对罗氏沼虾组织结构、抗氧化系统及免疫能力的影响

敖士齐，翟 乾，纪 鹏，高炜峰，李 杰，张晓君，高晓建，姜 群

(扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009)

亚甲基蓝又名次甲基蓝、美蓝，是一种人工合成的噻嗪类染料，作为孔雀石绿、硝基呋喃等禁药的替代品被广泛使用[1]，可以有效控制水产养殖中的烂鳃病、水霉病、红嘴病、小瓜虫病等常见疾病。与孔雀石绿相比，亚甲基蓝的毒性较低，但是，近年来研究发现，亚甲基蓝及其代谢物存在一定的毒副作用。例如，亚甲基蓝可导致神仙鱼(Symphysodonaequfasciatus)[2]、孔雀鱼(Poeciliareticulate)[3]、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[4]死亡，诱发天使鱼(Pterophyllumscalare)鱼鳔畸形[5]，损伤斑马鱼(Daniorerio)DNA结构[6]，对罗非鱼(Oreochromismossambicus)造成应激现象[7]，对凡纳滨对虾肠道、肝胰腺组织造成病理损害[8]等。目前，欧盟、美国等国家和地区已经禁止亚甲基蓝在食品动物生产中使用[9]，国内尚无相关法律和政策，水产养殖中亚甲基蓝的使用缺乏有效的管理。

罗氏沼虾(Macrobrachiurosenbergii)是我国重要的水产养殖经济物种，具有生长快、个体大、食性广、易驯养、适应性强、生产周期短等优点[10]。随着罗氏沼虾养殖密度和养殖规模的日益扩大，亚甲基蓝等水产消毒剂的使用已不可避免，鉴于亚甲基蓝的过量使用可对水产动物产生毒副作用，了解亚甲基蓝对罗氏沼虾的毒性效应，对于优化养殖生产中的使用剂量具有重要的实践意义。本研究采用半静水式方法开展急性毒性实验，探究亚甲基蓝对罗氏沼虾的半致死浓度和安全浓度，并将罗氏沼虾暴露于浓度为1/2 96 h LC50的亚甲基蓝4 d，后转移至清水养殖7 d，分析亚甲基蓝对罗氏沼虾组织结构、抗氧化系统及免疫能力的影响及可逆性，以期为罗氏沼虾的规范养殖和安全用药提供依据，并为亚甲基蓝对甲壳动物的毒性评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验设计与样品收集

实验所用罗氏沼虾来自扬州富源水产有限公司，个体健康、活力良好。随机选取体长为(3.5±0.5)cm的罗氏沼虾放入100 L的水族缸暂养，实验用水为充分曝气24 h的自来水，水温为(25±1)℃，每日清理食物残渣与粪便，日投喂两次商品化饲料，暂养7 d后进行实验，实验前1 d停止投喂，采用半静水式方法开展急性毒性实验，每日更换药液1次，日换水量50%。实验选用分析纯亚甲基蓝(含量98.5%，福晨化学实剂有限公司)，使用蒸馏水将其配置为500 mg/L浓度的母液备用，设计6个亚甲基蓝浓度梯度(3.125、6.25、12.5、25、50和100 mg/L)和一个空白对照组，每组设置三个平行，每个平行组随机放入20尾罗氏沼虾，每日统计并且记录各组罗氏沼虾存活情况，急性毒性实验持续96 h。数据采用Excel2016处理，通过浓度对数—死亡率线型回归方程，计算亚甲基蓝对罗氏沼虾的24、48、72和96 h的半致死浓度。采用特伦堡(Turubell)公式计算实验药品的安全浓度(SC)[11]，SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2。

为进一步探究亚甲基蓝对罗氏沼虾的毒性效应，将罗氏沼虾暴露于浓度为1/2 96 h LC50的亚甲基蓝4 d，去除亚甲基蓝后清水养殖7 d，暴露实验期间每日更换药液1次，日换水量50%，不含亚甲基蓝的清水养殖组为对照组，每组60尾罗氏沼虾。于实验的第0、1、2、4、7和11 d取样，每个时间点取6尾虾，解剖获得罗氏沼虾的肝胰腺、肠道和鳃组织，每尾样品取部分组织采用Bouin’s溶液固定，用于组织病理损伤研究，剩余组织样品液氮冷冻后于-80 ℃保存，用于酶活、基因表达分析。

1.2 组织病理损伤评估

经Bouin’s溶液固定48 h的肝胰腺、肠道和鳃组织，转入浓度为75%的乙醇中保存。通过梯度酒精浓度脱水处理后，用石蜡包埋，石蜡切片机制片，苏木精-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察并描述，拍摄主要病变部位。

1.3 生化指标测定

取-80 ℃保存的肝胰腺组织约100 mg，按比例加入生理盐水，采用电动匀浆仪充分匀浆，按照南京建成生物工程公司试剂盒说明书，用酶标仪进行吸光度检测，计算肝胰腺组织中丙二醛(MDA)和过氧化物(H2O2)含量，计算超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物(GSH-Px)、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的活性，评价亚甲基蓝对罗氏沼虾抗氧化系统和免疫因子的影响。

1.4 基因表达水平测定

取-80 ℃保存的肝胰腺组织约100 mg，液氮研磨后，采用Trizol法提取总RNA，采用1×TAE配置1%琼脂糖凝胶，与6×Loading buffer混合后上样，根据28 S和18 S条带完整性判断RNA质量。另取1 μL RNA用超微量紫外可见分光光度计(NanoReady Touch)检测RNA 浓度，采用HiScript III RT SuperMix for qPCR试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)完成反转录合成cDNA。本次实验中所用引物均使用Primer Premier 6.0软件设计，引物序列信息见表1，以β-肌动蛋白(β-actin)和延伸因子-1α(Elongationfactors-1α,EF1α)基因作为内参，目标基因为热休克蛋白(Heatshockprotei,HSP)、酚氧化酶原(Prophenoloxidase,proPO)、TOLL样受体(Toll-likereceptors,TLR)、凝集素(Lectin,LEC)，采用GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行荧光定量PCR(qRT-PCR)反应，反应体系为：SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物0.4 μL，cDNA 1 μL，用去离子水补足至20 μL，反应条件为：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 10 s，延伸60 ℃ 30 s，40个循环，所得到的结果采用2-ΔΔt法计算免疫基因的相对表达水平。

1.5 数据处理

免疫基因mRNA表达量及酶活数据采用平均值±标准差(mean±SD)表示，采用Levene法进行方差齐性检验，满足方差齐性的条件下采用SPSS Statistics 22软件进行单因素方差分析，采用SNK法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果

2.1 亚甲基蓝对罗氏沼虾的急性毒性

本实验以罗氏沼虾出现沉底，触摸无反应且无心跳为死亡表征。研究发现，急性毒性实验期间，对照组未发生个体死亡现象，而不同浓度亚甲基蓝暴露实验组，罗氏沼虾出现不同水平的死亡现象。实验初期，低浓度亚甲基蓝(3.125、6.25和12.5 mg/L)处理组中罗氏沼虾体色正常，活力与对照组无明显差异，高浓度组亚甲基蓝(25、50和100 mg/L)处理组中罗氏沼虾出现应激现象，主要表现为无规则运动增强。随着暴露时间的增加，罗氏沼虾出现体色加深变蓝，卧伏于水底等现象，直至死亡，死亡个体尾部肌肉泛蓝，头部发黑。亚甲基蓝暴露导致的罗氏沼虾死亡情况见图1，相同药物浓度胁迫下，罗氏沼虾死亡率随时间增加而升高，而同一时间点，亚甲基蓝浓度越高罗氏沼虾死亡率越高，亚甲基蓝对罗氏沼虾的毒性呈现明显的剂量与时间效应。通过浓度对数—死亡率线性回归方程，计算得到亚甲基蓝对罗氏沼虾的24、48、72和96 h的半致死浓度分别为209.7、54.7、6.1和2.8 mg/L，安全浓度为1.1 mg/L。

2.2 亚甲基蓝对罗氏沼虾的组织病理损伤

2.2.1 肝胰腺组织病理变化

图1 不同亚甲基蓝浓度下罗氏沼虾的死亡率Fig.1 Mortality rates of M.rosenbergiiexposed to different methylene blue concentrations

未经亚甲基蓝处理的罗氏沼虾肝胰腺如图2a所示，肝胰腺组织结构清晰，肝胰腺小管基膜完整管腔呈星型，细胞界限清晰，B细胞分布在肝小管周围多成马蹄形，R细胞有储存能量物质的作用胞内可见大小不等的转运泡，肝胰腺小管周围存在少量结缔组织所构成的基膜。1.4 mg/L亚甲基蓝暴露4 d的罗氏沼虾与对照组相比，少量肝胰腺小管管壁变薄管腔扩大刷状缘消失，部分管腔严重变形呈不规则形状，部分B细胞出现破裂，大量转运泡消失(图2b)。去除亚甲基蓝并在清水中恢复7 d后，肝胰腺组织结构部分恢复，管腔出现刷状缘，部分转运泡出现(图2c)。

图2 亚甲基蓝暴露对罗氏沼虾肝胰腺的组织病理损伤Fig.2 Histological structure of hepatopancreas tissue in M.rosenbergii following methylene blue exposure and decontamination

未经亚甲基蓝处理罗氏沼虾鳃组织如图3a所示，鳃组织中鳃丝排列整齐均匀，鳃丝上皮细胞以及次级层状上皮细胞结构完整形态正常，基部泌氯细胞致密均匀结构完整。1.4 mg/L亚甲基蓝暴露4 d后，罗氏沼虾鳃丝顶端次级层状上皮细胞出现肿大，鳃丝基部出现空泡和细胞裂解(图3b)。去除亚甲基蓝并在清水中恢复7 d后，鳃丝基部基本恢复，但鳃丝顶端次级层状上皮细胞依然膨大，未恢复对照组水平(图3c)。

2.2.3 肠道组织病理变化

未经亚甲基蓝处理罗氏沼虾肠组织如图4a所示，肠壁组织中黏膜层由排列紧密的柱状上皮细胞构成，上皮细胞向内褶皱形成肠绒毛，肠绒毛表面模糊可见粘膜上皮，柱状上皮细胞外侧为环状纵向肌层，最外侧由浆膜包裹，组织整体未见明显异常。1.4 mg/L亚甲基蓝胁迫4 d后，肠壁变薄肠道萎缩，肠绒毛结构消失，部分柱状上皮细胞缺失(图4b)。去除亚甲基蓝并在清水中恢复7 d后，肠绒毛结构消失症状仍然存在，柱状上皮细胞部分缺失(图4c)。

图3 亚甲基蓝暴露对罗氏沼虾的鳃组织形态的影响Fig.3 Histological structure of gill tissue in M.rosenbergii following methylene blue exposure and decontamination a：对照组鳃组织；b：亚甲基蓝处理第 4 d 鳃组织；c：转移至清水第 7 d 鳃组织；CC：泌氯细胞；EC：上皮细胞；SL：次级层状上皮细胞；▲：鳃丝基部损伤出现大量空泡；●：鳃丝基部基本恢复；★：鳃丝次级层状上皮细胞肿大。

图4 亚甲基蓝暴露对罗氏沼虾的肠组织形态的影响Fig.4 Histological structure of gut tissue in M.rosenbergii following methylene blue exposure and decontamination a：对照组肠道组织；b：亚甲基蓝处理第4 d肠道组织；c：转移至清水第7 d肠道组织；Ser：浆膜；Lum：肠道管腔；EPM：中肠柱状上皮细胞；Msz：环状纵向肌肉；▲：肠绒毛结构消失；●：柱状上皮细胞缺失。

2.3 亚甲基蓝对罗氏沼虾的氧化应激损伤

1.4 mg/L亚甲基蓝暴露导致罗氏沼虾活性氧水平和抗氧化酶活性发生明显变化(图5)。亚甲基蓝暴露导致SOD、GSH-Px酶活出现显著下降，SOD在暴露2 d后出现显著下降，在4 d达到最低，GSH-Px酶活于暴露后1 d出现显著下降，在4 d下降至最低水平，清水恢复3 d后，SOD、GSH-Px酶活均恢复至略低于对照组活性水平，7 d后恢复至对照组水平。H2O2和MDA含量在亚甲基蓝暴露后即出现积累，在暴露4 d后达到峰值，清水恢复7 d后，MDA含量逐渐恢复至对照组水平，H2O2含量仍高于对照组但差异不显著。

图5 亚甲基蓝胁迫对罗氏沼虾肝胰腺组织抗氧化系统的影响Fig.5 Effects of MB stress on the activities of antioxidant system in hepatopancreas of M.rosenbergiiT：亚甲基蓝暴露组；C：对照组；“*”和“**”表示显著差异(P<0.05)和极显著差异(P<0.01)。 下图同。

2.4 亚甲基蓝对罗氏沼虾免疫系统的影响

如图6所示，在1.4 mg/L亚甲基蓝暴露后，罗氏沼虾肝胰腺免疫因子碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的活性均受到严重影响，与对照组相比AKP在胁迫后1 d出现明显下降，在2 d达最低点，胁迫4 d后出现上升趋势，但显著低于对照组，清水养殖3 d后AKP活性恢复至对照组水平。ACP与AKP趋势基本相似，ACP在亚甲基蓝暴露第2 d出现显著下降，第4 d上升，转移至清水3 d后活性低于对照组但差异并不显著，清水养殖7 d后活性与对照组基本一致。

图6 亚甲基蓝胁迫对罗氏沼虾肝胰腺AKP和ACP活性的影响Fig.6 Effect of MB stress on AKP and ACP activities in the hepatopancreas of M.rosenbergii

除免疫因子外，亚甲基蓝暴露也导致罗氏沼虾肝胰腺免疫相关基因表达水平的变化(图7)。HSP基因在亚甲基蓝暴露后表达水平显著升高，其他三个免疫相关基因表达则出现显著下降。proPO和TLR基因在亚甲基蓝暴露2 d后表达水平显著下降，低表达水平持续至暴露后第4 d，清水恢复3 d后proPO和TLR基因表达水平恢复至对照组水平。LEC基因在亚甲基蓝暴露2 d后出现显著下降，暴露后4 d下降至最低点，清水恢复3 d后LEC基因表达水平仍低于对照组，直至清水恢复7 d后LEC基因表达水平高于对照组，但差异不显著。

图7 亚甲基蓝暴露对罗氏沼虾肝胰腺组织HSP、proPO、TLR和LEC基因表达的影响Fig.7 Effects of MB on the expression of HSP,proPO,TLR,LEC in hepatopancreas tissues of M.rosenbergii

3 讨论

3.1 亚甲基蓝对罗氏沼虾的毒性效应

据报道亚甲基蓝对金鱼苗(CarassiusauratusLinnaeus)[12]、三角鲂夏花鱼种(Megalobramaterminalis)[13]、高体鳑鱼苗(Rhodeusocellatus)[14]，长薄鳅幼鱼(LeptobotiaelongateBleeker)[15]的SC分别为2.36、1.24、0.96和0.93 mg/L。本研究发现，亚甲基蓝对罗氏沼虾的SC为1.1 mg/L，而在刘建勇等[4]的研究中亚甲基蓝对凡纳滨对虾蚤状幼体、糠虾幼体及仔虾的SC分别为0.025、0.029和0.073 mg/L，推测水产动物对亚甲基蓝的敏感性与物种及个体大小有关。此外，我们发现，罗氏沼虾对亚甲基蓝暴露初期敏感度较低，24 h LC50达到209.7 mg/L，但亚甲基蓝对罗氏沼虾的毒性效应随时间的延长逐渐加重，96 h LC50仅为2.8 mg/L。本实验采用浓度为1.4 mg/L亚甲基蓝暴露4 d，结果显示亚甲基蓝对罗氏沼虾造成不可逆的病理损伤和功能障碍，如肝胰腺细胞转运泡减少，肝胰腺小管变性，鳃丝基部出现大量空泡，鳃丝顶部出现肿大，肠道绒毛消失，柱状细胞缺失等病理损伤，并且在去除亚甲基蓝清水养殖7 d后部分损伤仍不可逆。因此建议养殖过程中采用短期浸泡方式进行杀菌消毒，应避免亚甲基蓝的长期使用。

3.2 亚甲基蓝对罗氏沼虾抗氧化防御系统的影响

在病原体入侵时，机体通过氧化应激产生大量的活性氧(ROS)，而抗氧化系统可以清除机体内过量ROS，避免机体受到氧化损伤，当抗氧化系统失衡，机体内产生造成细胞损伤的氧自由基(H2O2)和脂质过氧化产物(MDA)[16]。超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是水生动物机体抗氧化酶系统中的重要组成部分，是调节机体内氧化平衡的第一道防线[17]。SOD催化超氧化物歧化成H2O2，GSH-Px将H2O2还原成H2O和O2，阻止脂质过氧化反应，减缓氧化应激损伤[18]。本研究中，亚甲基蓝暴露导致SOD和GSH-Px活性显著降低，表明亚甲基蓝抑制抗氧化酶的活性。此外，本研究中H2O2和MDA含量在罗氏沼虾肝胰腺组织中显著上升，二者的积累表明罗氏沼虾体内产生大量氧自由基，并导致过氧化现象，标志着机体出现严重的氧化应激损伤[19]。暴露后的罗氏沼虾转移至清水养殖7 d后，上述指标均恢复至对照组水平，推测亚甲基蓝对罗氏沼虾抗氧化系统的损伤具有可逆性。

3.3 亚甲基蓝对罗氏沼虾免疫系统的影响

甲壳动物缺乏特异性免疫力，依靠非特异性免疫系统抵抗病原干扰，如细胞和体液免疫应答[20]。酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)是非特异性磷酸单酯水解酶，通过直接溶解或消化外源物质以达到防御的目的，反映了机体对外源性物质的防御力[21]，是评价甲壳动物免疫状态的重要指标[22]。AKP和ACP极易受外界环境影响，pH、温度、重金属、病原体等因素[23,24]均可导致其活性发生改变，本研究发现，亚甲基蓝暴露导致肝胰腺出现严重组织病理损伤，并显著降低罗氏沼虾AKP和ACP活性，相似的结果在敌百虫对克氏原螯虾(Procambarusclarkii)的毒性研究中也有报道[25]。除AKP和ACP外，热应激蛋白(heat shock proteins,HSP)，酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO)、Toll样受体(toll-likereceptor,TLRs)和凝集素(lectin,LEC)也是甲壳类动物重要的先天免疫因子。HSP又称热休克蛋白，是生物体内参与抗逆功能的重要蛋白，外界刺激(如高温、缺氧、病毒感染、自由基等)均可诱导热休克蛋白大量合成[26]。亚甲基蓝暴露后，罗氏沼虾HSP基因表达显著上调，表明亚甲基蓝可诱导罗氏沼虾合成热休克蛋白，增强对外界环境的抵抗力。proPO是酚氧化酶(PO)的前体物质，机体受到病原刺激后可触发酚氧化酶原激活系统，将proPO裂解为PO通过胞吐释放进入血淋巴，在病原体周围形成黑色素沉淀消灭病原[27]。TLRs是一种特殊结构模式识别受体，可广泛性识别病原微生物进化存在的保守分子[28]。LEC作为免疫效应分子凝集素，具有识别、黏附，调理，促吞噬等生理生化功能[29]。本研究中亚甲基蓝胁迫暴露导致proPO、TLR和LEC基因表达量显著下降，AKP和ACP活性降低，推测亚甲基蓝暴露可对罗氏沼虾免疫系统造成严重损害，清水养殖7 d后，上述免疫基因表达水平和酶活均恢复至对照组水平，推测1.4 mg/L浓度亚甲基蓝对罗氏沼虾非特异性免疫因子的损伤可逆。

4 结论

罗氏沼虾对亚甲基蓝较为敏感，1.4 mg/L浓度亚甲基蓝的持续暴露可导致罗氏沼虾肝胰腺、肠道和鳃组织的病理损伤，并破坏抗氧化系统和免疫系统，去除亚甲基蓝并于清水中恢复7 d后，大部分损伤可恢复，然仍有部分组织病理损伤不可逆。