咪达唑仑调控miR-214/MAPK/ERK-CREB通路对缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞增殖及凋亡的影响

舒蕤 赵立芳 彭井印 张如意

(滨州医学院附属医院麻醉科，山东 滨州 256603)

脑缺血再灌注损伤是临床常见的一种病理过程，海马神经元细胞增殖、凋亡异常是脑缺血再灌注损伤发生的重要原因之一，因而如何减轻脑缺血再灌注损伤成为研究重点〔1～3〕。咪达唑仑属于γ氨基丁酸受体激动剂，其具有镇静、抗焦虑等作用，咪达唑仑通过激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)-细胞外调节蛋白激酶(ERK)途径而抑制氧化应激诱导的神经元细胞凋亡从而减轻细胞损伤〔4〕。但咪达唑仑对缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞损伤的影响及其可能作用机制尚未阐明。miR-214-3p在阿尔茨海默病中表达水平降低，并可通过抑制自噬而减轻认知障碍〔5〕。miR-214可调控丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信号通路而参与口腔癌的发生过程，已有研究表明MAPK/ERK-环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)通路被激活后可促进海马神经元细胞凋亡而造成细胞损伤〔6，7〕。但咪达唑仑是否可通过调控miR-214/MAPK/ERK-CREB通路而减轻脑缺血再灌注损伤尚未可知。本研究采用缺氧复氧诱导大鼠海马神经元细胞建立细胞损伤模型，探讨咪达唑仑对缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞增殖、凋亡的影响及其对miR-214/MAPK/ERK-CREB通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 咪达唑仑购自江苏恩华药业股份有限公司；大鼠海马神经元细胞购自美国模式菌种收集中心(ATCC)细胞库；DMEM培养基购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000、凋亡检测试剂购自北京索莱宝科技有限公司；MAPK/ERK-CREB通路抑制剂PD98059(母液20 mg/ml)购自碧云天生物技术研究所；anti-miR-con、anti-miR-214购自广州锐博生物科技有限公司；噻唑蓝(MTT)试剂购自广州劳斯生物科技有限公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；兔抗鼠、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗鼠MAPK、p-ERK、p-CREB抗体与IgG二抗购自美国Abcam公司。

1.2实验分组 大鼠海马神经元细胞置于密闭缺氧的培养箱内(95% N2、5%CO2)缺氧处理4 h，将其转移至37℃、体积分数5%CO2正常培养箱复氧处理24 h〔8〕，记为缺氧复氧组。同时将正常培养的细胞记为NC组。大鼠海马神经元细胞加入含有不同浓度(3、6、12 μmol/ml)咪达唑仑的培养基处理24 h后进行缺氧复氧处理〔9〕，分别记为3、6、12 μmol/ml咪达唑仑+缺氧复氧组。anti-miR-con、anti-miR-214分别转染入大鼠海马神经元细胞后加入12 μmol/ml咪达唑仑处理24 h后进行缺氧复氧处理，分别记为12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-con组、12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组。anti-miR-214转染入大鼠海马神经元细胞后加入12 μmol/ml 咪达唑仑与50 μmol/L抑制剂PD98059处理24 h后进行缺氧复氧处理〔10〕，记为PD98059+12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组。

1.3MTT检测细胞增殖 收集各组海马神经元细胞接种于96孔板(150 μl/孔)，每孔加入质量浓度为5 mg/ml的MTT溶液20 μl，继续培养4 h后弃上清，加入150 μl DMSO，室温避光振荡孵育5 min后应用酶标仪检测各孔吸光度值(A值)。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组海马神经元细胞加入预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后弃上清，将500 μl结合缓冲液加入细胞沉淀后分别加入5 μl膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)与5 μl碘化丙啶(PI)，振荡摇晃孵育10 min后应用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)检测细胞中miR-214的表达水平 收集各组海马神经元细胞后采用Trizol法提取RNA，反转录合成cDNA，PCR扩增反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-214相对表达量。

1.6Western印迹检测MAPK、p-ERK、p-CREB、Bax、Bcl-2蛋白表达 提取各组海马神经元细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后使用5%脱脂奶粉封闭2 h，4℃条件下孵育一抗稀释液(1∶1 000)过夜，TBST洗涤，室温条件下孵育二抗稀释液(1∶2 000)1 h，滴加电化学发光(ECL)显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.7统计学处理 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1不同浓度咪达唑仑对缺氧复氧处理的大鼠海马神经元细胞活性的影响 与NC组比较，缺氧复氧组细胞活力明显降低(P<0.05)；与缺氧复氧组比较，3、6、12 μmol/ml咪达唑仑+缺氧复氧组细胞活力明显升高(P<0.05)。见表1。

2.2不同浓度咪达唑仑对缺氧复氧处理的大鼠海马神经元细胞凋亡的影响 与NC组比较，缺氧复氧组细胞凋亡率明显升高，Bax蛋白水平明显升高，Bcl-2蛋白水平明显降低(P<0.05)；与缺氧复氧组比较，3、6、12 μmol/ml咪达唑仑+缺氧复氧组细胞凋亡率明显降低，Bax蛋白水平明显降低，Bcl-2蛋白水平明显升高(P<0.05)。见表1、图1、图2。

2.3不同浓度咪达唑仑对缺氧复氧处理的大鼠海马神经元细胞中miR-214表达水平的影响 与NC组比较，缺氧复氧组miR-214的表达水平明显降低(P<0.05)；与缺氧复氧组比较，3、6、12 μmol/ml咪达唑仑+缺氧复氧组miR-214表达水平明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度咪达唑仑对缺氧复氧处理的大鼠海马神经元细胞活性、凋亡和细胞中miR-214表达水平的影响

1～5：对照组、缺氧复氧组、3 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组、6 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组、12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组；图2同

图2 Western印迹检测各组Bax、Bcl-2蛋白表达

2.4下调miR-214表达抑制咪达唑仑对缺氧复氧处理的大鼠海马神经元细胞的影响 与12 μmol/ml咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-con组比较，12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组细胞活力降低，凋亡率升高，Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图3、表2。

2.5缺氧复氧处理的大鼠海马神经元细胞中MAPK/ERK-CRE通路相关蛋白表达 与NC组比较，缺氧复氧组MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明显升高(P<0.05)；与缺氧复氧组比较，12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明显降低(P<0.05)；与12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-con组比较，12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白水平明显升高(P<0.05)。见表3、图4。

1，2：12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-con组、12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组

表2 下调miR-214表达抑制咪达唑仑对缺氧复氧处理的大鼠海马神经元细胞的影响

表3 缺氧复氧处理的大鼠海马神经元细胞中MAPK/ERK-CRE通路相关蛋白表达

1～5：对照组、缺氧复氧组、12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组、12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-con组、12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组

2.6抑制剂PD98059可以逆转miR-214下调表达对咪达唑仑处理的缺氧复氧大鼠海马神经元细胞的影响 与12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组比较，PD98059+12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组细胞活力升高，凋亡率降低，MAPK、p-ERK、p-CREB、Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5、表4。

1，2：12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组、PD98059+12 μmol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-miR-214组

表4 抑制剂PD98059可以逆转miR-214下调表达对咪达唑仑处理的缺氧复氧大鼠海马神经元细胞的影响

3 讨 论

咪达唑仑可减轻脂多糖诱导的肝损伤而对肝脏组织发挥保护作用〔11〕。咪达唑仑可通过调控JNK-ERK途径而抑制氧化应激诱导的神经细胞凋亡从而减轻细胞损伤〔12〕。本研究结果提示,咪达唑仑可促进缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞增殖。本研究结果与相关文献报道结果相似〔13〕，咪达唑仑可抑制缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞凋亡。

本研究结果提示，咪达唑仑可能通过上调miR-214的表达而减轻缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞损伤。研究表明，miR-214在脂多糖诱导的脓毒症、急性肾损伤等疾病中表达异常，还可减轻神经细胞损伤〔14～16〕。本研究结果提示，抑制miR-214表达可拮抗咪达唑仑对缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞增殖及凋亡的作用。MAPK家族成员的作用为将细胞外信号转导入细胞内部，其与ERK1/2在海马区可发挥重要调控作用，ERK通路激活后可促进CREB发生磷酸化而调控神经元增殖及凋亡等过程〔17，18〕。本研究结果提示，咪达唑仑可能通过调控miR-214/MAPK/ERK-CREB通路而发挥作用。同时，本研究为进一步证实上述猜测，将MAPK/ERK-CREB通路抑制剂与miR-214抑制剂添加至缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞中，结果提示咪达唑仑可通过促进miR-214的表达而抑制MAPK/ERK-CREB通路从而发挥作用。

综上，缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞中miR-214的表达水平降低，咪达唑仑可促进miR-214的表达而促进缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞增殖及抑制细胞凋亡，其作用机制与抑制MAPK/ERK-CREB通路的活化有关。