磷酸肌酸钠预处理对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用

王亚光 钟一 高利丽 蔡宏宇

(锦州医科大学附属第一医院 1心内科，辽宁 锦州 121001；2内分泌与代谢疾病科；3肾内科)

肺缺血再灌注损伤(LIRI)常导致移植后原发性移植物功能障碍(PGD)，是导致移植后发病和死亡的主要原因〔1〕。许多接受肺动脉血栓内膜切除术和体外循环的患者或那些从镰状细胞肺危象中恢复过来的患者也会有某种形式的LIRI。通过再灌注，形成活性氧，激活细胞内的一系列有害效应〔2，3〕。肺移植后缺血再灌注迅速激活先天免疫系统促进炎症与损伤。LIRI涉及供体肺细胞与受血者免疫细胞之间复杂的炎症通讯，导致危及生命的水肿、器官功能障碍和细胞死亡〔4〕。由于缺血预处理涉及机械损伤及伦理，相比较而言，药物预处理是更为理想的治疗方法，因为它不仅无创、安全，最重的是能有效减轻肺缺血再灌注损伤，因而具有非常广阔的临床应用前景。磷酸肌酸作为细胞内的能量载体，能够维持细胞的活性及基本功能〔5〕。外源性磷酸肌酸作为重要的能量补充剂，在治疗能量供应不足导致的机体病理变化中发挥着重要作用。此外，磷酸肌酸的膜稳定作用、抗氧化作用、神经保护作用等正逐渐被证实〔6，7〕。本研究旨在探讨磷酸肌酸钠预处理对大鼠肺LIRI的保护作用。

1 材料与方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠32只，体重250～300 g，由锦州医科大学实验动物中心提供，显微镜装置购于日本OLUMPUS公司，全自动血气分析，购于美国Nova biomedical公司，多功能酶标仪，购于瑞士TECAN公司，酶标仪，购于美国BIOTEK公司，双垂直蛋白电泳仪、凝胶成像系统购于北京六一公司。总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)试测定试剂盒，肿瘤坏死因子(TNF)-α、大鼠白细胞介素(IL)-1β ELISA检测试剂盒。髓过氧化物酶(MPO)试剂盒，购于南京建成公司。注射用磷酸肌酸钠购于海口力奇制药股份有限公司。

1.2大鼠肺缺血再灌注模型 大鼠术前自由进食，自由饮水，在22°C下，12 h光/12 h暗周期，湿度为65%，可自由获取食物和水，20%乌拉坦(500 μl/100 g)麻醉，仰卧位固定于手术台上，常规剪毛、消毒、铺巾，取颈前正中切口3 cm，逐层切开分离颈前皮下组织及颈前肌肉组织，暴露、游离气管，14 G静脉留置导管气管插管，接小动物呼吸机，呼吸机参数设置为呼吸频率80次/min，吸呼比1∶2，潮气量8 ml/kg，右颈静脉注射肝素(100 IU/kg)抗凝。待动物呼吸稳定后，取左侧胸部第5肋间隙前外侧切口，切开胸壁皮肤后，切断胸壁肌肉逐层进胸，打开胸腔，精细游离并暴露左侧肺门，以无损伤血管夹夹闭左肺门45 min后开放(阻断后肺塌陷，颜色变为暗紫色，开放后再次膨胀，颜色变为淡红色)。再灌注120 min，实验全部结束后，采用安乐死的方法处死大鼠(静脉注射3倍麻醉剂量的乌拉坦)。

1.3实验分组 健康雄性SD大鼠，32只，体重250～300 g，由锦州医科大学实验动物中心提供，10～15周龄，分笼饲养，自由喂水，统一批次，按笼分层随机均分为Sham组、Sham+磷酸肌酸钠组、LIRI组、LIRI+磷酸肌酸钠预处理组各8只。尼可地尔粉剂80 mg充分溶解于100 ml蒸馏水中。Sham组：只进行假手术，开胸后仅游离肺门，不做夹闭处理，其他操作同模型组。Sham+磷酸肌酸钠组：实验大鼠进行假手术，并以40 mg/kg的磷酸肌酸钠予以大鼠尾静脉注射。LIRI组：以无损伤血管夹夹闭左肺门45 min后开放(阻断后肺萎缩，变为暗紫色，开放后肺迅速膨胀，颜色恢复淡红色)，再灌注120 min后静脉取血，处死大鼠并收集肺组织。LIRI+磷酸肌酸钠预处理组，实验大鼠在LIRI的操作前15 min以40 mg/kg的磷酸肌酸钠予以大鼠尾静脉注射。

1.4检测肺组织病理学 2 h再灌结束后，苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化〔9〕。肺损伤评分标准见表1。

表1 肺损伤评分表

1.5血气分析检测及氧合指数(OI)和呼吸指数(RI)的计算 再灌注120 min后，各组大鼠取动脉血，测氧分压(PaO2)，二氧化碳分压(PaCO2)和pH值。OI=PaO2/吸氧浓度(FiO2)。RI=〔肺泡动脉氧分压差(P(A-a)DO2)/PaO2〕。P(A-a)DO2=(大气压-PH2O)×FiO2-PaCO2/R-PaO2。其中PH2O为蒸汽压，取恒值47 mmHg，R=0.8，大气压统一采用760 mmHg。

1.6肺干湿比重(W/D)的测定 首先，大鼠安乐死后采集肺组织，在磷酸盐缓冲液(PBS)中短暂冲洗，擦拭，然后称重以获得湿重。在80℃干燥72 h后测定肺的干重，以湿体重除以干体重来计算W/D。

1.7MDA、SOD的检测 取组织进行准确称取，然后按重量(g)∶体积(ml)=1∶9的比例加入9倍的生理盐水，冰浴条件下机械匀浆，2 500 r/min，离心10 min，制备成10%的匀浆上清液。将组织匀浆上清进行蛋白含量测定。使用MDA、SOD试剂盒测定其含量。

1.8肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β的测定 2 h再灌注结束，收集肺泡灌洗液，离心后保存于-20℃冰箱中至实验使用，肺泡灌洗液600 g经过800 r/min离心10 min去除沉淀物。按照试剂盒说明，TMB显色液显色，酶标仪450 nm读取吸光值，以标品浓度(pg/ml)为纵坐标，对应光密度(OD)为横坐标，运用Curve Exert1.3软件来画标准品的线性回归曲线，然后按曲线方程来算出各样本的浓度值。

1.9MPO活性的测定 冰浴的条件下进行机械的匀浆，制备成10%匀浆，按照试剂盒说明操作。MPO的活力(U/g组织湿重)=(测定OD值-对照OD值)/〔11.3×取样量(g)〕。

1.10肺组织中细胞凋亡的测定 用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)染色来检测肺凋亡率。

1.11统计学方法 采用SPSS13.0软件进行方差分析、Dunn检验。

2 结 果

2.1肺组织病理学变化 2 h再灌注结束后，用HE染色测定肺组织损伤的组织学证据。Sham组及Sham+磷酸肌酸钠组肺组织结构及肺泡完整，肺间隔无明显增厚，无炎性细胞浸润；LIRI组肺组织结构发生明显改变，肺泡堵塞，肺泡形态不完整，大量血液渗出，炎性细胞大量浸润且分布广泛，部分集结成团；LIRI+磷酸肌酸钠预处理组肺组织结构仍有一定变化，肺间隔增厚，有血液渗出，可见部分炎性细胞浸润。见图1。与Sham组比较，Sham+磷酸肌酸钠组肺质伤评分〔(0.128±0.025)分〕差异无统计学意义。LIRI组肺损伤评分〔(0.428±0.026)分〕明显高于Sham组〔(0.122±0.022)分，P<0.01〕。LIRI+磷酸肌酸钠组肺损伤评分〔(0.311±0.029)分〕明显低于LIRI组(P<0.01)。

2.2血气分析检测及OI和RI Sham和Sham+磷酸肌酸钠组pH、PO2、PCO2、OI、RI无显著差异(P>0.05)。LIRI组PaO2、OI明显低于Sham组，PaCO2、RI明显高于Sham组(P<0.01)。LIRI+磷酸肌酸钠组PaO2、OI均显著高于LIRI组，PaCO2、RI显著低于LIRI组(均P<0.05)。见表2。

2.3W/D 与Sham组比较，Sham+磷酸肌酸钠组W/D无明显差异(4.314±0.312 vs 4.332±0.279，P>0.05)。与LIRI组相比，LIRI+磷酸肌酸钠组W/D显著降低(5.193±0.342 vs 6.231±0.298，P<0.01)。

2.4氧化应激系统的检测 与Sham组比较，Sham+磷酸肌酸钠组MDA、SOD含量无明显差异(P>0.05)，LIRI组MDA含量明显升高，SOD含量明显降低(均P<0.01)。与LIRI组相比，LIRI+磷酸肌酸钠组肺组织中MDA含量明显降低，SOD含量明显升高(均P<0.01)。见表2。

2.5肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β的测定 与Sham组比较，Sham+磷酸肌酸钠组肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量无明显差异(P>0.05)，LIRI组肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量明显升高(P<0.05)。与LIRI组相比，LIRI+磷酸肌酸钠组肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β浓度明显降低(P<0.05)。见表3。

图1 4组肺组织(HE染色，×100)

表2 各组血气分析和呼吸参数及MDA、SOD水平比较

表3 磷酸肌酸钠预处理对肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的影响

2.6MPO活性的测定 与Sham组比较，Sham+磷酸肌酸钠组在肺组织中MPO活性无明显差异〔(1.079±0.126) vs (1.150±0.67)U/g,P>0.05〕。与LIRI组〔(2.993±0.149)U/g〕相比，LIRI+磷酸肌酸钠组MPO〔(2.578±0.161)U/g〕活性明显降低(P<0.05)。

2.7肺组织中细胞凋亡的测定 细胞核内有褐色颗粒的细胞染色呈阳性，正常细胞核是蓝色。与Sham组相比，Sham+磷酸肌酸钠组的比例无明显差异〔(2.738±1.376)%vs (3.023±1.578)%，P=0.656〕。LIRI组凋亡细胞比例〔(44.768±15.398)%〕明显高于Sham组(P<0.01)，LIRI+磷酸肌酸钠组凋亡细胞比例〔(27.498±6.178)%〕明显低于LIRI组(P=0.038)。见图2。

图2 4组肺组织TUNEL染色检测凋亡细胞(×400)

3 讨 论

LIRI是一种常见的临床现象，多见PCI术后、急性心肌梗死的溶栓治疗后、心肺复苏和器官移植等血管开通后过程中。肺极容易受到损伤，尽管在免疫抑制方面和手术的管理的进步，而肺移植的结局往往是固体器官脏器抑制结局最差的〔10〕。肺移植的成功受的移植肺功能丧失的限制，主要是由LIRI引起，缺血再灌注诱导胞死亡是导致肺功能衰竭和肺组织损伤的重要原因。其机制与肺泡的损伤和血管通透性有关。能量代谢障碍是发病基础，氧自由基作用是重要发病环节〔11〕。磷酸肌酸是人体内源性的高能化合物，通过“肌酸穿梭”机制完成线粒体氧化磷酸化成三磷酸腺苷(ATP)维持机体正常的能量代谢〔12〕。在病理情况下(缺血缺氧)，能量产生受阻，磷酸肌酸迅速将其磷酸键转移至二磷酸腺苷(ADP)，防止或延迟ATP 的耗尽〔13〕。在脑、心等脏器缺血情况下发挥巨大作用，尤其在心脏疾病中有广泛的临床应用，但却在LIRI中还缺乏基础及相关的临床研究。LIRI是多分子、多机制、相互影响的病理演变过程，其发生的机制可能有：无菌性免疫反应(先天性免疫、获得性免疫)、补体激活、凝血激活、细胞死亡途径的激活(凋亡、坏死、自噬)、内皮功能异常、自由基氧化作用等有关〔14〕。强大的氧化应激，是迅速发生再灌注后LIRI的主要启动因子，MDA，氧化应激介导的脂质过氧化的标志，SOD是重要的抗氧化酶〔15〕。MDA是氧化应激所致损伤的一个标志，而SOD水平通常用于评估对细胞毒性活性氧物种的一级防御〔16〕。肺细胞凋亡在LIRI中起着重要作用〔17〕。磷酸肌酸钠预处理在 LIRI开始前15 min以40 mg/kg的剂量静脉注射，可显著降低肺组织病理学改变，改善肺功能。肺组织中MDA及肺水肿程度减轻，SOD活性显著升高。磷酸肌酸钠预处理明显降低肺组织细胞凋亡率。TNF-α和IL-1β的表达在肺缺血再灌注早期显著上调。中性粒细胞在肺内的激活和积聚是产生肺损伤的重要因素〔18〕，而MPO是中性粒细胞脱颗粒释放的溶酶体，其表达水平的升高表明白细胞在肺内浸润程度高〔19〕。磷酸肌酸钠预处理降低肺组织中MPO含量表达，降低支气管肺泡灌洗液的炎症介质表达，表明尼可地尔可以抑制肺缺血再灌注产生的炎症反应起到保护作用。

本研究验证了磷酸肌酸钠预处理的有效性，在大鼠肺LIRI模型中，具有肺保护作用。其次磷酸肌酸钠预处理可能的肺保护机制。其机制可能是通过抑制活性氧生成和抗细胞凋亡有关，抑制无菌性免疫炎症反应。这将为扩大磷酸肌酸钠在临床上的应用提供新的理论依据，其进一步的作用机制值得更深层次的研究。