清热熄风活血汤调控JNK/p38 MAPK信号通路改善脑梗死大鼠脑组织损伤的干预机制

庄志江 张丽红 兰瑞

(1河南中医药大学第一附属医院脑病二区，河南 郑州 450099；2郑州大学附属肿瘤医院中西医结合科；3河南中医药大学第一附属医院脑病五区)

脑梗死即为缺血性脑卒中，在全部脑卒中类型中占比高达85%左右，是临床最为常见的脑血管疾病〔1,2〕。据相关流行病学调查数据显示，中老年人群为脑梗死的高发群体，近年来我国人口老龄化现象不断加重，每年新增脑梗死病例数呈现连年上升趋势，引起广大专家学者的关注〔3,4〕。脑梗死具有发病急、严重程度高、致残、致死率高、预后差的特点，因此寻找一种安全有效的治疗手段对脑梗死治疗、预后改善具有重要意义〔5,6〕。有研究表示，西医手段治疗脑梗死，临床疗效并不十分理想，因此越来越多的专家学者致力于中医药治疗脑梗死的研究〔7〕。本研究设计实验，建立脑梗死大鼠模型，使用清热熄风活血汤进行干预，探究清热熄风活血汤干预效果及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 选取30只SD健康雄性大鼠(郑州大学动物研究院，使用许可证号：SYXK(豫)2018-0004)，8～10周龄，平均(9.0±0.8)周龄；体重225～247 g，平均(235.9±8.8)g。在相对湿度50%～55%、温度(23.1±2.4)℃的环境中喂养1 w，光照12 h/d。主要试剂：兔抗大鼠γ-干扰素(IFN-γ)抗体(Hyclone公司)；大鼠抗小鼠白细胞介素(IL)-2、IL-4抗体(Selleck公司)；兔抗小鼠大鼠总抗氧化能力(TAOC)、一氧化氮(NO)抗体(Gibco公司)；大鼠抗小鼠IL-22、IL-3抗体(BD公司)；小鼠抗兔磷酸化氨基末端蛋白激酶(p-JNK)、磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38(p-p38 MAPK)抗体(Dako公司)。

1.2建模及分组干预 选取10只大鼠作为正常组，其余20只建立脑梗死模型：将建模大鼠在实验台固定后麻醉干预，颈部消毒处理后剪开正中位置皮肤，显微镜下操作，分离颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)，近心端结扎近端ECA，微动脉夹夹住ICA，结扎固定CCA，大鼠脑组织中动脉阻断后去除微动脉夹，根部固定ICA，消毒缝创。建模过程中死亡2只，将其余18只脑梗死大鼠随机分为脑梗死组、清热熄风活血汤组各9只。清热熄风活血汤组使用清热熄风活血汤进行干预：石决明20 g，茯神、夜交藤各15 g，天麻、钩藤各12 g，川牛膝、山栀、桑寄生、黄芩、益母草、杜仲各10 g，清水浸泡药材0.5 h，加水煎1.5 h，取药汁，对大鼠进行灌胃处理。正常组、脑梗死组均使用同剂量生理盐水灌胃处理。

1.3指标检测

1.3.1学习记忆能力、神经功能评分 在直径1.5 m、高0.5 m的圆形水池加半池27℃水，池壁顶端作4个标记点，池水中央放置0.3 m高平台，分别于各标记点使大鼠入水，记录所有大鼠入水后到达平台所用时长，若大鼠2 min后未达到预置平台，则人工引至平台，此时潜伏期记为120 s。所有大鼠在预置平台上停留0.5 min，将其于其他标记点再次置入水中，连测5 d。使用大鼠神经功能缺损(mNSS)评分表对大鼠神经功能进行评价，评价项目包括运动、感觉、反射、平衡状况等，最高分18分，评分越低表示大鼠神经功能损伤越轻。

1.3.2脑梗死面积、含水量检测 各组大鼠麻醉后颈椎脱臼法处死，取出脑组织冷藏，30 min后2 mm厚度切片，添加2%氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液进行染色，30 min后使用4%甲醛固定，6 h后拍照、计算梗死面积。含水量：吸取脑组织表面水分后称重并记录，使用烤箱将脑组织烤至恒重，称量脑组织干质量，脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量。

1.3.3苏木素-伊红(HE)染色 将脑组织固定后浸泡于4%甲醛中1 d，取出后进行石蜡包埋、连续切片。切片烤干后脱蜡，依次使用不同浓度酒精进行复水处理。苏木素染色15 min，取出清洗3次，盐酸酒精分化处理30 s后进行充分清洗，1%伊红染色，酒精脱水，脱蜡后封片，显微镜观察。

1.3.4辅助性T细胞(Th)1/Th2趋化因子、氧化应激、炎症反应指标水平检测 使用酶联免疫吸附试验进行检测：取各组大鼠腹部静脉血3 ml,2 000 r/min离心15 min后-40℃保存。稀释标准品、标记酶标板，设置空白孔、标准孔、待测标本孔，并分别加入终止液和显色剂、标准品、血清标本和抗体，封膜并摇晃均匀，使用37℃保温箱保存1 h后取出，去膜后清洗，将水分吸干后于各孔中添加显色剂摇晃均匀，待显色后加入终止液，以空白孔为基准，使用酶标仪测450 nm处吸光值，计算IFN-γ、IL-2、IL-4、TAOC、活性氧(ROS)、细胞间黏附分子(ICAM)-1、IL-3水平。

1.3.5Western印迹检测JNK/p38 MAPK通路蛋白相对表达量 提取50 μg蛋白，煮沸至蛋白变性、凝胶电泳十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白分子切开凝胶转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，Western封闭液室内封闭待测、内参蛋白1.5 h，1∶1 000添加待测蛋白抗体，1∶2 000添加内参抗体孵育1 d，取出后使用Western洗涤液清洗5次，1∶5 000加入山羊抗兔，Western洗涤液洗涤后显色、曝光、成像。

1.4统计学处理 采用SPSS26.0软件进行F检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组脑组织病理学观察 如图1所示，正常组脑组织细胞细胞核清晰，排列规则，细胞结构正常，未出现病理改变状况；脑梗死组脑组织细胞细胞核破裂，排列杂乱，出现间质水肿、炎性细胞浸润情况；清热熄风活血汤组脑组织细胞肿胀、细胞核破裂、炎性细胞浸润状况相对较轻。

图1 各组脑组织病理学观察(HE染色，×400)

2.2各组学习记忆能力、神经功能评分情况 如表1所示，脑梗死组、清热熄风活血汤组各时间点逃避潜伏期长于正常组，具有统计学差异(P<0.05)；清热熄风活血汤组各时间点逃避潜伏期短于脑梗死组，具有统计学差异(P<0.05)；清热熄风活血汤组mNSS评分低于脑梗死组，具有统计学差异(P<0.05)。

2.3各组脑梗死面积、脑组织含水量情况 如表1所示，脑梗死组、清热熄风活血汤组脑组织含水量高于正常组，具有统计学差异(P<0.05)；清热熄风活血汤组脑组织梗死面积、脑组织含水量均低于脑梗死组，具有统计学差异(P<0.05)。

表1 各组学习记忆能力、神经功能评分及脑梗死面积、脑组织含水量比较

2.4各组Th1/Th2趋化因子水平比较 如表2所示，与正常组比较，脑梗死组、清热熄风活血汤组IFN-γ水平较低，IL-2、IL-4水平较高，具有统计学差异(P<0.05)；与脑梗死组比较，清热熄风活血汤组IFN-γ水平较高，IL-2、IL-4水平较低，具有统计学差异(P<0.05)。

2.5各组氧化应激、炎症反应严重程度对比 如表3所示，与正常组比较，脑梗死组、清热熄风活血汤组TAOC、ROS、ICAM-1、IL-3水平较高，具有统计学差异(P<0.05)；与脑梗死组比较，清热熄风活血汤组TAOC、ROS、ICAM-1、IL-3水平较低，具有统计学差异(P<0.05)。

表2 各组Th1/Th2趋化因子水平比较

2.6各组JNK/p38 MAPK通路蛋白相对表达量对比 如表3、图2所示，与正常组比较，脑梗死组、清热熄风活血汤组p-JNK、p-p38 MAPK表达较高，具有统计学差异(P<0.05)；与脑梗死组比较，清热熄风活血汤组p-JNK、p-p38 MAPK表达较低，具有统计学差异(P<0.05)。

表3 各组氧化应激、炎症反应严重程度及JNK/p38 MAPK通路蛋白相对表达量对比

1～3:正常组，脑梗死组，清热熄风活血汤组

3 讨 论

脑梗死是一种临床常见的神经系统疾病，患者主要临床表现为头晕头痛、偏瘫、步态失常、恶心呕吐、大小便失禁等，严重影响患者身体健康、生命安全〔8,9〕。据世卫组织调查数据显示，脑梗死症状具有较高发病率、复发率，绝大多数复发脑梗死患者会出现终身残疾，因此对脑梗死进行及时有效的治疗，降低脑梗死复发率对患者预后改善具有重要意义〔10,11〕。介入、溶栓、手术治疗等均为常用的治疗脑梗死的手段，但临床疗效并不十分理想。我国传统中医认为脑梗死的主要病机为年老体弱、肝亏肾虚、经脉痹阻等，清热熄风活血汤具有清热、平肝阳、滋肝补肾的作用。

研究表明，脑梗死患者神经功能、认知功能受到明显损伤，改善患者神经功能、认知功能是临床治疗脑梗死、改善患者预后的关键〔12,13〕。本研究说明脑梗死症状的发生发展导致一定程度的认知功能、神经功能损伤，使用清热熄风活血汤进行干预能够减轻脑梗死大鼠神经功能损伤程度，提升大鼠学习记忆能力，具有一定神经损伤保护作用。本研究还发现，使用清热熄风活血汤进行干预的脑梗死大鼠脑组织梗死面积、含水量明显下降，进一步体现出清热熄风活血汤的脑保护作用。

研究表明，Th1/Th2平衡失调参与脑梗死症状的发生发展〔14〕，IFN-γ、IL-2、IL-4均为Th1/Th2趋化因子，本研究结果显示，脑梗死大鼠出现Th1/Th2平衡失调状况，使用清热熄风活血汤干预能够调节脑梗死大鼠Th1/Th2平衡，改善大鼠免疫应答。

临床研究表明，脑梗死症状的发生发展伴随着机体脑组织氧化应激损伤、炎症反应〔15,16〕。脑组织氧化应激、炎症反应会导致机体脑组织损伤、神经功能缺损，抑制脑组织氧化应激、炎症反应是治疗脑梗死、改善患者神经功能和预后的关键〔17,18〕。本研究结果说明，脑梗死大鼠脑组织出现一定程度的氧化应激损伤及炎症反应，从而导致脑梗死大鼠神经功能缺损。本研究说明，使用清热熄风活血汤进行干预能够有效减轻脑梗死大鼠脑组织氧化应激损伤、炎症反应，这可能也是清热熄风活血汤减轻脑梗死大鼠神经功能缺损的重要机制之一。

有学者表示，脑梗死症状的发生发展与神经元细胞异常凋亡具有密切联系〔19,20〕。JNK/p38 MAPK通路能够介导神经元细胞分化、凋亡，还能够分化炎性因子，在脑血管疾病发生发展过程中发挥重要作用〔21,22〕。本研究结果显示，使用清热熄风活血汤进行干预能够调控JNK/p38 MAPK通路蛋白表达，抑制脑梗死大鼠神经元细胞凋亡，减轻神经系统损伤严重程度，起到脑保护作用。

综上所述，使用清热熄风活血汤对脑梗死模型大鼠进行干预，能够有效改善脑梗死大鼠认知功能、神经功能，其作用机制可能是清热熄风活血汤干预能够减轻脑梗死大鼠脑组织氧化应激、炎症反应，调控JNK/p38 MAPK通路，抑制神经元细胞凋亡，从而发挥脑保护作用，为脑梗死的治疗提供一定的理论依据。