MicroRNA在肝细胞癌诊断和治疗中的研究进展

李运杰,龚建华,姚汝铖综述,郑 军审校

0 引 言

肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是发生在肝脏的一种恶性肿瘤,可分为原发性肝癌和继发性肝癌两大类,其中肝细胞癌是最常见的原发性肝癌,是目前全球第六大最常见的肿瘤,也是第三大癌症相关死亡原因［1］。低生存率归因于晚期诊断、治疗耐药性、肿瘤复发和转移,因此强调需要新的诊断和治疗方法。HCC目前治疗方法包括手术选择(切除或肝移植)、消融电化学疗法(如射频消融或乙醇注射)以及非消融治疗(如化疗栓塞、放射性栓塞和立体定向放射治疗)［2］。作为HCC的主要治疗手段,手术治疗只对早期HCC患者疗效较好,同时手术后的早期肝癌复发主要为肿瘤细胞沿门静脉途径进行肝内微转移及多中心起源复发因素导致,针对不同患者病情实现解剖性肝切除联合部分区域非解剖性肝切除对于术者有一定技术难度要求［3］。此外,其他治疗方式也有着一定的局限性,如消融治疗较难处理较大肿瘤和肝内多发肿瘤以及肝移植缺少适宜的器官供体等［4］。

MicroRNA(miRNA)是内源性小的非编码RNA(长度约为19～25个核苷酸),通过降解信使RNA(mRNA)或通过结合靶mRNA抑制翻译来调节基因表达,从而充当启动子或抑制子来控制的细胞增殖、迁移、侵袭和发展［5-6］。每个miRNA被认为靶向数百个mRNA,它们是基因表达的强大调节因子。通过以上途径miRNA能够调节约30%的人类基因,其中与癌症相关的miRNA根据功能分可为两类:致癌miRNA(oncomiRs)和抑癌miRNA(TS-miR)［7］。在癌症发展过程中致癌miRNA主要表现为上调趋势,抑癌miRNA则表现为下调趋势。目前越来越多的研究通过表观遗传修饰手段(miRNA,DNA甲基转移酶/去甲基化酶和组蛋白甲基转移酶/去甲基化酶)调控HCC发生和发展,证明了miRNA具有成为HCC诊断生物标志物或新型治疗策略的潜力［8］。本文对miRNA在HCC中表达水平的失调以及miRNA作为HCC诊断和治疗的最新研究进展作一综述。

1 HCC中miRNA的失调

目前研究中miRNA的失调的机制仍知之甚少,可能是由于编码基因的遗传改变,如突变,扩增,缺失或融合,也有学者表示失调的转录因子和DNA甲基化是导致miRNA表达障碍的主要原因［9］。在各种癌症类型中,如胃肠道、泌尿系、肺癌等均可观察到相应的miRNA的失调［10-12］。研究发现HCC的发生发展与miRNA的表达异常也具有较强的相关性:与病毒性肝炎、酒精肝、肝纤维化等肝病及健康对照相比,HCC中部分miRNA的表达水平存在着显著差异,具有一定特异性［13-14］。根据恶性肿瘤的发展过程,HCC中表达失调的miRNA调控作用主要体现在肿瘤细胞的增殖与凋亡、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、肿瘤微环境形成、以及迁徙转移四个过程中。miR-21是目前研究较多的miRNA,在诸多肿瘤中表达异常上调,其靶向负调节肿瘤抑制基因PTEN和MAP2K3,通过 PI3K/Akt 信号通路加速肿瘤细胞细胞从G1到S期的转变,从而导致肿瘤的增殖［15］。此外,HCC细胞还可以分泌直接靶向PTEN的外泌体miRNA-21,外泌体是细胞外囊泡的一种,是直径小于200 nm的小囊泡,通过体液移动,外泌体miRNA-21可导致肝星状细胞中PDK1 / AKT信号传导的激活,同时也可以激活肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAF)通过分泌血管生成细胞因子VEGF,MMP2,MMP9,bFGF和TGF-β进一步促进癌症迁徙和肿瘤血管生成［16］。同样被证实可促进HCC增殖的miRNA还有miR-542-3p、miR-142、miR-122,它们在HCC中均以表达下调的形式促进细胞的增殖与EMT过程［17-19］。也有研究表明miR-183-5p上调了糖酵解相关基因(PKM2,HK2,LDHA,GLUT1)的表达,通过增加葡萄糖摄取和糖酵解,改变肿瘤微环境并促进了肝癌细胞的迁移和侵袭［20］。Zhao等［21］通过实验研究证明了miR-424-5p靶向负调节哺乳动物自噬相关基因14(ATG14),ATG14的抑制会促进细胞自噬行为,这可能是抑制肝癌发展的另一条重要通路。由此可见HCC相关miRNA在肿瘤的作用并不单一,作用通路复杂多样,单个miRNA往往可参与恶性肿瘤行为的多个环节。越来越多的HCC相关miRNA机制的发现与完善,为探索miNRA能否成为高效、安全、精准的生物标志物和治疗靶点提供了可靠理论基础。

2 MiRNA在HCC诊断中的作用

在HCC诊断的传统方式中,甲胎蛋白(α-Fetoprotein,AFP)是目前最广泛使用的HCC生物标志物,但其敏感性和特异性较低,对于早期直径<2 cm的微小肝癌,患者多数没有表现出AFP水平的升高,因此在肝癌起病早期使用AFP诊断HCC的灵敏度甚至低于25%［22］。此外,肝炎和肝硬化患者体内的AFP也可能升高,导致其在诊断HCC时出现较高的假阳性率［23］。而在HCC发展的各个临床阶段中,都能发现miRNA表达水平的异常,miRNA相比传统AFP筛查HCC可能更可靠。目前有国外学者总结出了肝细胞和HCC细胞系之间的miRNA谱差异,通过检测各种miRNA的表达水平用于区分HCC患者与健康对照组和其他肝病患者,虽然仍需要长期及大量临床数据验证其临床价值及可靠评价范围,不可否认,miRNA谱作为生物标志物具有巨大的研究潜力［24-26］。有研究表明,通过AFP与miRNA联合检测来诊断早期HCC时似乎更能够提高诊断的特异度以及灵敏度。Tomimaru等［27］发现通过单独检测miR-21或者联合检测miR-21和AFP在区分HCC患者与慢性肝炎患者或健康对照方面较单独检测AFP效果更好。另一项研究表明,通过对miR-16、AFP和AFP-L3联合检测在诊断HCC时具有高度特异性［28］。Zhao等［29］通过920份临床数据分析说明血清 miR-122 对健康人群及肝炎患者的肝细胞癌筛查具有重要意义,但也指出单独的血清miR-122对于肝硬化或发育不良结节形成的患者与HCC鉴别会存在失误。Ma等［30］指出miR-196a2、miR-146a、miR-499以及miR-149等miRNA表达的失调可能增加肝癌的相关风险,有望成为肝癌潜在的生物标志物。除对HCC有较好的诊断作用以外,通过检测体内某些miRNA的表达水平还能够对HCC患者治疗后的效果以及预后进行判断［31］。Chen等［32］研究表明,miR-497在HCC中的潜在靶基因包括ARL2,UBE2Q1,PHF19,APLN,CHEK1,CASK,SUCO,CCNE1和KIF23。这九个基因的低表达与HCC患者更好的预后有关,AUTS2是miR-1246的新型靶基因,其低表达与HCC患者总生存率低有显著关系。综上,miRNA在HCC各阶段发生与发展中的表达异常使miRNA有望成为HCC早期诊断和准确分期的新型诊断工具。

3 MiRNA在HCC治疗中的作用

3.1 下调致癌miRNA表达致癌miRNA异常高表达通过直接与多个肿瘤抑制基因结合而下调这些mRNA的表达,从而导致癌细胞的生长、移动和转移。Callegari等［33］发现miR-221作为一种致癌miRNA,其在HCC中表达水平明显增高,试验小组通过基因敲定下调小鼠体内miR-221的表达能够抑制小鼠体内HCC的增长。因此,抑制致癌miRNA的表达是治疗HCC可探寻的有效治疗策略。反义单链核苷酸是一种miRNA类似物,能够通过竞争性抑制从而降低miRNA的表达水平,已被作为miRNA抑制剂广泛使用。已有研究证明miR-21抑制剂可以明显降低miR-21的表达水平,同时能够有效地抑制肿瘤的生长［34］。此外,Li等［35］也通过实验发现miR-210的过度表达与乙肝相关性肝硬化和HCC密切相关,通过抑制miR-210的表达能够促进肝癌细胞的凋亡,表明miR-210抑制剂可能是治疗乙肝相关性HCC的一种潜在治疗方式。另有研究表明,抑制miR-494的表达能够显著减小HCC肿瘤大小［36］。因此,通过抑制致癌miRNA的表达可以抑制HCC肿瘤细胞的生长并减少HCC的远处转移,可能成为一种新型的无创HCC治疗方案,尤其是针对索拉菲尼耐药的晚期肝癌患者治疗提供新思路。

3.2上调抑癌miRNA表达水平除使用致癌miRNA抑制物下调致癌miRNA的表达外,通过上调HCC中表达被抑制的抑癌miRNA的表达水平似乎也是一种有效的治疗方式［37］。有研究表明,miR-638在人类HCC中显著下调,通过上调miR-638的表达水平能够诱导肝癌细胞凋亡和自噬,发挥较为明显的肿瘤抑制作用［38］。此外,Zhang等［39］通过实验发现通过基因修饰能够促使miR-498过度表达,而miR-498的过度表达可以显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在HCC中,miR-4310被发现表达水平低下,其通过靶向脂肪酸合成酶和硬脂酰辅酶A去饱和酶-1抑制脂质合成,Li等［40］上调细胞中miR-4310的表达发现HCC肿瘤的迁徙和转移被抑制,使预后得到改善。有研究发现增强HCC细胞中miR-193a表达能促进肝癌细胞凋亡和抑制细胞增殖,并可增加对索拉非尼的敏感性,进一步增强其抗肿瘤治疗效果［41］。Ning等［42］也通过实验证实了向肿瘤部位递送外源性miR-122,其直接靶向细胞周期蛋白G1,从而抑制HCC细胞的增殖,这说明可以通过改变miRNA的细胞含量水平能够影响体内HCC的生长与转移。此外,有学者通过敲低HCC细胞中致癌lncRNA小核仁RNA宿主基因1(SNHG1),减少SNHG1竞争性结合抑癌miR-376a,从而达到较强的肿瘤抑制结果,这为研究miRNA基因治疗靶点提供了新思路［43］。相较于HCC的手术治疗等有创治疗方式,通过调节miRNA的表达水平从而抑制HCC的发展与扩散更加方便。此外,miRNA不编码蛋白质,因此通常不具有免疫原性,与经典的HCC基因治疗相比,基于miRNA的基因治疗具有更加广阔的前景。

3.3联合治疗策略虽然miRNA可能在治疗HCC时具有较好的疗效,然而,血清中富含核酸酶,单独使用miRNA制剂会导致miRNA被降解从而降低疗效,而且还可能对体内其它正常组织造成一定的影响。因此,需要使用联合治疗策略来减少miRNA制剂的体内降解,同时降低其对正常组织所产生的影响。Wischhusen等［44］通过超声靶向微泡破坏技术联合miR-122以及miR-21抑制剂对HCC进行治疗,不仅能够防止miRNA在血清内的过度降解,还能够实现miRNA局部释放的效果,实现了HCC的高效治疗。Ning等［45］使用靶向大分子联合递送化疗药物5-氟尿嘧啶以及miRNA-122对HCC进行治疗,结果显示药物在血清中具有良好的稳定性,有效地抑制HCC细胞的增殖,进一步诱导HCC细胞凋亡。Tian等［46］发现HCC细胞的酸性微环境会增加HIF-1α和HIF-2α基因的表达,并刺激了外泌体miR-21和miR-10b的生成,通过碱化细胞微环境或者减少癌细胞中糖酵解或许是另一种可选联合治疗方案。另有研究表明,当使用腺病毒载体对miRNA进行传递时,腺病毒会在HCC中高效转录,同时miRNA也会持续高水平表达。此外,使用组织特异性启动子可以将这种表达限制在特定的细胞类型,大大降低由于基因片段插入而导致基因突变的风险［47］。相较于单独利用miRNA对HCC进行治疗,联合治疗策略能够安全快捷的将miRNA运送至靶部位或改善miRNA的作用环境,从而实现HCC的高效治疗［48-49］。

4 结语与展望

目前,miRNA作为HCC的生物标志物在诊断和治疗HCC方面已经取得了巨大的进展,一定程度上克服了手术治疗创伤性大和化学治疗耐药性强等的局限性。值得一提的是,使用联合治疗策略在方便快捷地递送miRNA的同时还能够实现治疗的安全性以及高效性,进一步提高了miRNA在HCC治疗中的适用性。与此同时,虽然miRNA在治疗和诊断HCC时有着巨大的潜力,但仍有许多问题亟待解决。首先,目前单独使用miRNA对HCC进行诊断还具有不确定性,不排除其他病因导致的miRNA表达异常干扰对HCC的诊断,或许可以采用多种miRNA或者miRNA联合其他生化指标增加诊断的准确性。其次,调控miRNA的表达水平似乎可以调节HCC对化疗药物的敏感性,因此,化疗药物联合miRNA共同治疗HCC或许是一种很好的治疗方式。最后,需要寻找更加适宜的miRNA传递模式,为miRNA在临床上治疗肝癌提供可能。