云南省无量山乌骨鸡传染性支气管炎和大肠杆菌混合感染的诊断

耿志诚，宋春莲，张 莹，罗 高，李鑫汉，罗班乾，李 鲜，舒相华*

（ 1.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201 ； 2.昆明伟牧得生物科技有限责任公司，云南 昆明 650201 ； 3.云南省永德县畜牧兽医局，云南 临沧 677600 ； 4.云南省昭通市畜牧局，云南 昭通 657000 ）

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一类急性、高接触性、传染性呼吸系统疾病[1]，是肉鸡、蛋鸡养殖过程中常见的一种传染病。IB的易感动物为各日龄的鸡，病程持续较短，一般2 d内即出现症状，症状为咳嗽、打喷嚏、气喘、呼吸道啰音、流泪流涕、精神沉郁、昏睡等[2]。IB具有潜伏期短、发病急、传播途径广、传播迅速的特点，易出现大规模感染，且变异性强，变异毒株多，对疫病防控净化造成了很大挑战[2-4]。大肠杆菌病是由肠杆菌科致病性大肠埃希菌引起的局部性或全身性感染。大肠杆菌是一类机会致病菌，当饲养条件差或宿主免疫力低下时会引起发病，主要引起宿主肠炎，严重时可导致败血症、心包炎、卵黄性腹膜炎或死亡等，严重危害鸡场经济效益[5]。大肠杆菌既可单一发病，也可继发感染其他病毒性疾病，如新城疫、禽流感、IB等[6]。

近年来，鸡场疾病发病情况趋于多重病原混合感染的趋势。混合感染不仅加快了发病进程，也会导致一些特征症状不明显，对鸡场经济效益造成更大损失，加大了诊断和防治的难度[7]。无量山乌骨鸡属于云南省六大名鸡之一，一鸡场内乌骨鸡出现精神高度沉郁、呼吸困难、腹泻等症状，本研究采用临床观察及病理解剖、分子生物学检测技术、细菌分离培养、生化鉴定、药敏试验和病理组织切片进行诊断，为大肠杆菌和IBV混合感染的诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

云南省大理市某鸡场有无量山乌骨鸡3 000羽，未接种IB疫苗。发病后传染迅速波及全群，病死率20%。选取发病症状明显的病鸡2只无菌剖解及采集病变内脏组织。

1.2 主要仪器

电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）、电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、WD-9413B凝胶成像分析仪（北京六一生物科技有限公司）、冷冻高速离心机（Thermo Scientific）、303-S电热恒温培养箱（沪南试验仪器厂）、DYY-6C电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、TKY-BMB型石蜡包埋机（湖北泰康医疗设备有限公司）、病理组织切片机（REICHERT HISTOSTAT）。

1.3 主要试剂

组织RNA提取试剂盒（TaKaRa）、反转录试剂盒（TaKaRa）、LB营养琼脂（北京索莱宝科技有限公司）、麦康凯琼脂（北京索莱宝科技有限公司）、巧克力血琼脂培养基基础（北京索莱宝科技有限公司）、SS琼脂（北京索莱宝科技有限公司）、生化鉴定试剂盒（广州环凯微生物生物科技有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 临床诊断及病理解剖

观察病鸡整体情况，并对其精神状况、天然孔、体表被毛进行全面系统的检查；结合对畜主询问发病鸡总体生理情况、免疫情况和健康水平，进行初步评估和记录。

按照顾城均[8]的方法进行病理解剖，并做好解剖记录。取临床症状明显的2只发病鸡进行病理剖解，并对剖解病变部位进行无菌采样，以进行下一步检测。

1.4.2 分子生物学检测

取鸡病变明显组织液氮研磨后，加入1 mL PBS，按照核酸提取试剂盒说明书按照步骤提取核酸。

反应体系：DNA/cDNA模板2 μL、上下游引物各0.5 μL、Ex Taq Premix 12.5 μL，加去离子水补足至25 μL。

扩增程序为：97 ℃预变性5 min，97 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃扩增10 min。退火温度见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

取7 μL PCR产物1.5%浓度琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像分析仪上查看结果。

1.4.3 细菌分离培养

无菌采取病变部位，采用接种环蘸取病料后分别接种于高压灭菌的LB培养基、麦康凯培养基、血平板和SS培养基上。置于37 ℃恒温箱内培养12 h，对培养皿内生长的单菌落挑菌落进行纯培养，纯培养12 h后对培养基内细菌进行革兰氏染色镜检。

1.4.4 生化鉴定试验挑取纯培养后的菌落，按照生化鉴定试剂盒说明书进行生化鉴定试验。

1.4.5 药敏试验

从培养皿中挑选细菌菌落加入装有LB肉汤的离心管中，放入37 ℃恒温振荡器中振荡培养24 h，在LB培养基上均匀涂开，根据革兰氏染色及生化试验结果选定菌种敏感的抗生素贴上药敏片，37 ℃恒温箱中培养24 h后，测量抑菌圈直径。

结果判定标准：按照WS/T 125—1999肠杆菌科药敏试验直径解释标准进行判定，其中S表示敏感，I表示中介，R表示耐药。

1.4.6 病理组织切片观察

取病变明显的组织用甲醛∶蒸馏水1∶9稀释后浸泡固定，24 h后换液。将固定好的组织取出后切成薄片，按照石蜡切片及HE染色步骤进行切片染色，镜检切片观察病变明显的组织。

2 结果与分析

2.1 临床症状及病理剖解结果（见图1）

由图1（a）可知，发病鸡精神高度沉郁、呼吸困难、呼吸有啰音，肛周被羽凌乱且沾有粪便，腹泻有黄棕色稀便。

由图1（b）、图1（c）可知，剖解可见发病鸡鼻腔、气管、支气管内有浆液性分泌物；由图1（d）可知，肺脏有出血淤血现象、有肺实质变性呈虾肉样变；由图1（e）、图1（f）可知，肠道鼓气、肠壁变薄，切开有黄色泡沫状内容物，盲肠扁桃体有炎性肿大。

2.2 分子生物学诊断结果

根据病鸡临床症状及解剖情况，诊断为呼吸系统疾病，相关PCR检测结果见图2。

由图2可知，1号鸡、2号鸡在249 bp处均有明亮条带，且无杂带，其余3种疾病均无条带，故诊断为IB阳性。

图2 分子生物学诊断结果Fig.2 Molecular biological diagnosis results

2.3 细菌分离培养结果及生化鉴定试验结果

2.3.1 革兰氏染色镜检结果（见图3）由图3可知，麦康凯培养基和SS培养基上长出粉红色菌落，挑取单菌落纯培养经革兰氏染色，镜检可见革兰氏阴性短杆状细菌单个存在。

图3 革兰氏染色镜检结果Fig.3 Microscopic examination results of Gram staining

2.3.2 生化鉴定试验结果

经生化鉴定试验可知，该菌株发酵葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖蔗糖和木糖试验阳性，明胶试验、VP试验和硫化氢试验阴性，结果符合大肠杆菌的生化特性。根据革兰氏染色和生化鉴定结果，判定此菌为大肠杆菌。

2.4 药敏试验结果（见表2）

由表2可知，该大肠杆菌对头孢喹肟、阿莫西林、磺胺甲恶唑、四环素、多西环素和头孢曲松钠等6种抗生素显示耐药，对新霉素显示敏感。

表2 药敏试验结果Tab.2 Results of drug sensitivity test

2.5 病理组织切片观察结果（见图4）

由图4可知，通过镜检病理组织切片可见，发病鸡肺部病变明显，肺泡内血液渗出及炎性渗出物浸润。

图4 病理组织切片观察结果Fig.4 Observation results of pathological tissue section

2.6 治疗

根据PCR检测结果以及药敏试验结果，在鸡群日粮中添加抗病毒复方中药及新霉素；推荐使用扶正解毒散（方剂组成为板蓝根300 g、黄芩60 g、淫羊藿30 g），打粉过筛后添加于日粮中，也可煎煮后添加于饮水中，每天两次，连续饲喂一周。

此外，日粮和饮水中添加复合维生素B及维生素C以增强鸡群对病原的抵抗力。发病后对鸡群进行紧急免疫接种，雏鸡采用双倍剂量滴鼻点眼，成鸡通过饮水的方式紧急接种产生IB抗体，症状严重的鸡酌情加倍剂量，没有治疗价值的发病鸡应及时淘汰并无害化处理。

3 讨论

我国家禽规模化养殖迅猛发展，家禽养殖的产业化水平较高，但集约化程度却与饲养管理技术成反比。规模化养殖的高饲养密度带来较高经济效益的同时，也加速了疾病在群体中的传播速度。我国肉鸡养殖面临的主要问题是病原微生物的复杂化和临床症状非典型化，混合感染是威胁肉鸡养殖的重大问题[9-11]。

有报道指出，感染IBV的禽类呼吸道黏膜会出现纤毛脱落、停止摆动，黏膜上皮对大肠杆菌等病原的抵抗力降低，导致混合感染[7,12]。而大肠杆菌感染后会导致腹泻、食欲不振等症状，混合感染后加重病情、增加病死率。有研究报道，2020年6月广西某火鸡场内火鸡出现了肿头、流泪、精神沉郁等症状，并出现死亡，经过鉴别诊断确定为IBV混合感染大肠杆菌[13]。广西某鸡场对出现呼吸道症状及腹泻的发病鸡进行隔离，但仍出现更多发病鸡，求助当地兽医部门后确诊为IBV及大肠杆菌病混合感染[14]。本研究中，发病鸡诊断为IBV混合感染大肠杆菌，加重鸡群发病情况并导致鸡群病死率增高，产生耐药性的大肠杆菌也阻碍了鸡场对本轮疫病的防控。

目前尚无针对IB的特效药，故应注重预防，防大于治[15]。鸡群发病后应及时隔离病鸡，并对鸡舍进行彻底消毒。保持良好的饲养管理环境，保持鸡舍勤清理消毒及良好通风，禽舍内集群密度控制在合理范围内，保持鸡舍周围安静、减少鸡群应激是防止鸡群免疫力低下的必要基础[11]。发生大肠杆菌与IBV混合感染时，应对鸡场中的粪便及无治疗价值的发病鸡进行无害化处理，对鸡群进行严格检疫、隔离制度[16]，并紧急接种IB疫苗，应根据细菌分离培养及药敏试验的结果有针对性地选用抗菌药物治疗大肠杆菌病[17-18]。后续饲养应在鸡饲料中添加复方中药制剂起到抗炎抗病毒、提高鸡群对病原微生物的抵抗能力。本试验中，结合药敏试验结果选择抗菌药、抗病毒药物进行治疗后，该鸡场内疫情得到了有效控制。

4 结论

本研究结果表明，该鸡群发病的原因为IB与大肠杆菌混合感染，且大肠杆菌已产生一定的耐药性。