未足月胎膜早破孕妇胎盘中Toll样受体4/髓样分化因子/核因子-κB通路表达及临床意义

刘莎莎， 赵 云， 李晓旭， 张 仙， 陈菲菲

未足月胎膜早破（preterm prelabor rupture of membranes，PPROM）是指未满37周临产前发生的胎膜破裂，发病率较低，仅为3%左右[1]，但临床危害性极大，对产妇及胎儿的生命健康均造成极大威胁。PPROM不仅使胎膜结构发生改变，还会对产妇的免疫功能造成直接影响[2]。宫内感染是PPROM的常见并发症，同样也是PPROM发病的主要原因[3]，当孕产妇受到感染时，机体的炎症反应被激活，稳态平衡被打破，病原菌由产道上行引发宫内感染、早产、新生儿感染甚至死亡等严重后果[4]。Toll样受体4（Tolllike receptor 4，TLR4）是免疫应答和病原菌识别的重要受体[5]，可调控下游分子髓样分化因子（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88） 和 核 因子 -κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）参与介导机体免疫反应、抗炎、抗病毒感染等过程[6]。随着对PPROM孕妇宫内感染的不断探索，有研究指出，TLR4、NF-κB等分子在PPROM孕妇宫内感染的发生发展中发挥重要的调控作用，并可一定程度上预测宫内感染的发生[7-8]。然而，目前尚不清楚，TLR4/MyD88/NF-κB通路在PPROM孕妇胎盘中的表达水平是否发生变化，且该通路的表达是否与宫内感染的发生有关。基于此，本次研究对PPROM并发宫内感染孕妇胎盘中TLR4/MyD88/NF-κB通路的表达水平进行检测，对比其与未感染患者的差异，试图揭示PPROM并发宫内感染新的分子通路和机制，为临床预防和诊断PPROM并发宫内感染提供更多理论支持。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2017年6月—2020年6月湖北省妇幼保健院收治的PPROM患者90例，按照是否合并宫内感染将患者分为感染组（32例）和非感染组（58例），另选同期正常分娩孕妇50名作为对照组。对比各组人群年龄、孕次、产次等一般资料，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 入选各组人员的一般资料Table 1 Clinical data of patients compared in terms of infection

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：所有入组对象均为单胎妊娠；PPROM患者孕周均低于37周；经临床检查结合患者症状确诊为胎膜早破；感染组患者符合宫内感染相关诊断标准[9]；均为22～35岁适龄产妇。

排除标准：前置胎盘产妇；多囊卵巢综合症；合并妊娠期高血压、高血压史者；合并泌尿系统感染及其他感染性疾病者；35岁以上高龄产妇；对照组孕妇排除胎膜早破和宫内感染等临床症状，且未发现体温升高情况。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 分娩前，对感染组患者外阴进行消毒处理，以阴道窥器暴露宫颈，采用棉签刮取宫颈管内分泌物及黏液，将棉签置于无菌试管内，由检验科医师对病原微生物进行培养和鉴定。此外，于PPROM患者分娩后，取距离胎膜破口处最近的胎盘组织，另取对照组产妇正常胎盘组织，均保存于-80℃条件下，以进行TLR4/MyD88/NF-κB通路的检测。

1.3.2 病原菌鉴定分析 将收集到的感染组患者的宫颈分泌物和黏液接种于血平板（厂家：上海沪峥生物科技有限公司；货号：HZZ105）中，置于含CO2的细胞培养箱（厂家：南京贝登医疗股份有限公司；型号：BPN-80CRH）内进行细菌培养，当警报为阳性时，采用全自动细菌分析仪（厂家：济南童鑫生物科技有限公司；型号：MA120）对感染组标本中病原菌进行鉴定和分析。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测TLR4/MyD88/NF-κB通路的mRNA表达水平 取先前收集到的临近胎膜破口处的胎盘组织和正常胎盘组织，采用Trizol总RNA提取试剂（厂家：上海邦景实业有限公司；货号：BJS964333；规格：100 mL）对组织内的总RNA进行抽提，然后将总RNA逆转录成cDNA，TLR4、MyD88、NF-κB引物序列设计见表2，设置反应条件为94℃5 min，94℃30 s，72℃30 s，循环40次，72℃5 min，使用qRT-PCR仪（厂家：济南来宝医疗器械有限公司；型号：MA-6000）检测以GAPDH作为标准化内参时胎膜中TLR4/MyD88/NF-κB通路的相对mRNA表达水平。

表2 TLR4/MyD88/NF-κB通路引物设计Table 2 Primers used in this study for amplifying TLR4/MyD88/NF-κB pathways

1.3.4 Western bolt法检测 TLR4/MyD88/NF-κB 通路的蛋白表达水平 取先前收集到的临近胎膜破口处的胎盘组织和正常胎盘组织，采用全蛋白试剂盒（厂家：上海博湖生物科技有限公司；货号：BH-S63616）提取各组织中的总蛋白，采用BCA法测定蛋白水平后将缓冲液加入目标蛋白中，凝胶电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜上，以浓度为5%的脱脂奶粉室温下封闭2 h后，分别滴加TLR4、MyD88、NF-κB p65和 β-actin一抗，稀释比均为1∶1 000，4℃下孵育一夜，次日滴加辣根过氧化物酶标记的相应羊抗兔二抗，室温下孵育2 h后以增强化学发光法显色，以上所有试剂盒均购自上海Abcam公司，均严格按照试剂盒说明书要求操作，采集图像后对比各组条带灰度值。

1.3.5 统计学分析 采用SPSS 22.0软件处理数据，计量资料以表示，多组比较采用方差分析，组间比较采用SNK-q检验，两组间比较采用t检验。受试者工作特征（ROC）曲线评估TLR4/MyD88/NF-κB通路对于PPROM并发宫内感染的诊断效能，计数资料率用n（%）表示，单因素分析以χ2检验，多因素分析采用logistic回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病原菌分析

32例感染患者阴道分泌物中检出78株病原菌，其中革兰阳性菌36株，占46.2%，革兰阴性菌33株，占42.3%，真菌9株，占11.5%，见表3。

表3 感染患者阴道分泌物病原菌种类及株数Table 3 Species of pathogens isolated from vaginal secretions of patients with intrauterine infection

2.2 胎盘中TLR4/MyD88/NF-κB通路的表达

与对照组相比，非感染组和感染组患者胎盘 组 织 中 TLR4、MyD88、NF-κB 的 mRNA 和蛋白水平均显著升高（P＜0.05），且感染组患者TLR4、MyD88、NF-κB的 mRNA 和蛋白水平显著高于非感染组（P＜0.05），见表4、图1、图2。

图2 各组胎盘中TLR4/MyD88/NF-κB通路的蛋白表达Figure 2 Protein expression levels of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in placenta compared between patients and controls

表4 各组胎盘中TLR4/MyD88/NF-κB通路的表达Table 4 Expression levels of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in placenta compared between patients and controls

图1 各组胎盘中TLR4/MyD88/NF-κB通路的mRNA表达Figure 1 The mRNA expression levels of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in placenta compared between patients and controls

2.3ROC曲线评估TLR4/MyD88/NF-κB通路对PPROM并发宫内感染的诊断价值

ROC 曲 线 评 估 TLR4、MyD88和 NF-κB 的mRNA表达水平对PPROM并发宫内感染的诊断价值，结果发现，当TLR4表达高于13.8、MyD88表达高于24.0、NF-κB表达高于26.6时，诊断PPROM并发宫内感染有较高的效能（P＜0.05），见表5、图3。

图3 ROC曲线评估TLR4/MyD88/NF-κB通路对PPROM并发宫内感染的诊断价值Figure 3 ROC curves for evaluating the performance of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in diagnosing preterm premature rupture of membranes-associatd intrauterineinfection

表5 ROC曲线评估TLR4/MyD88/NF-κB通路对PPROM并发宫内感染的诊断价值Table 5 ROC curves illustrating the value of TLR4/MyD88/NF-κB pathways in diagnosing preterm premature rupture of membranes-associated intrauterine infection

2.4 PPROM并发宫内感染单因素分析

收集PPROM患者临床资料，分析导致PPROM并发宫内感染的危险因素，结果发现，PPROM并发宫内感染与患者的破膜孕周和阴道检查次数有关（P＜0.05），而与破膜后待产时间、流产史和引产史无关（P＞0.05），见表6。

表6 PPROM并发宫内感染单因素分析Table 6 Univariate analysis of the risk factors for preterm premature rupture of membranes-associated intrauterine infection

2.5 PPROM并发宫内感染多因素分析

将上述影响PPROM并发宫内感染的危险因素纳入logistic多因素回归分析，以是否并发宫内感染（是=1，否=0）作为因变量，TLR4 mRNA水平（＞13.8=1，≤13.8=0）、MyD88 mRNA水平（＞24.0=1，≤24.0=0）、NF-κB mRNA 水 平（＞26.6=1，≤26.6=0）、破膜孕周（≤33周=1，＞33周=0）和阴道检查次数（＞5次=1，≤5次=0）作为自变量，分析引起宫内感染的独立危险因素，结果发现，TLR4/MyD88/NF-κB通路异常高表达、破膜孕周越小、阴道检查次数越多，并发宫内感染的风险越高（P＜0.05），见表7。

表7 PPROM并发宫内感染多因素分析Table 7 Multivariate analysis of risk factors for intrauterine infection associated with preterm premature rupture of membranes

3 讨论

目前学术界普遍认为，PPROM和宫内感染具有相互影响、互为因果的关系，宫内感染既是PPROM的病因，又是其重要并发症之一[10]。孕妇怀孕期间，通过羊水和胎盘与胎儿进行营养物质交换，若胎儿在母体内未发育成熟，胎膜即出现破裂情况，极易导致病原菌侵入，激活机体炎症反应[11]，中性粒细胞等免疫细胞聚集于绒毛膜和羊膜，逆行感染引起子宫腔内感染，进而导致早产、死胎、新生儿感染、脑损伤等严重后果[12]。因此，如何在早期对PPROM孕妇并发宫内感染进行监测和诊断对提高母婴预后至关重要。基于此，本研究检测PPROM并发及未并发宫内感染孕妇的胎盘内TLR4/MyD88/NF-κB通路的表达，分析导致宫内感染的影响因素，旨在为PPROM并发宫内感染患者的早期预防、监测和治疗提供更多方向。

本研究从32例感染患者阴道分泌物中检出78株病原菌，革兰阳性菌占46.2%，以金黄色葡萄球菌为主；革兰阴性菌占42.3%，以大肠埃希菌为主；真菌11.5%，均为白念珠菌。过往研究指出，细菌、病毒、衣原体、支原体等病原微生物均可通过血源性等方式入侵宫腔，引发绒毛膜羊膜炎[13]。当孕妇出现PPROM时，阴道流液和浆性分泌物增多，阴道pH值由弱酸性变为碱性[14]，而金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌等病原菌最适宜在37℃、碱性环境下繁殖，胎膜破裂导致的阴道环境改变加速了病原菌增生，使其更易上行感染至宫腔[15]。因此，在对PPROM并发宫内感染患者进行治疗时，应选择对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌抗菌活性更强的抗生素，防止产褥期感染、新生儿感染等疾病的发生发展。

PPROM并发宫内感染的致病因素较为复杂，宫腔内压力过大、羊膜囊受力不均、孕期缺乏必需的微量元素均会导致感染风险加剧[16]。相关资料显示，妊娠期高血压、高血糖、胎盘前置等因素均是引发宫内感染的危险因素[17]。本研究在排除基础疾病和前置胎盘等因素的干扰后，发现PPROM并发宫内感染与患者的破膜孕周和阴道检查次数有关（P＜0.05），而与破膜后待产时间、流产史和引产史无关（P＞0.05），这也与曹怡等[18]的研究结果较为一致。推测原因可能为，破膜孕周越小，胎儿发育尚不成熟，此时分娩可能会影响胎儿的存活率，且极易对胎儿心、脑、肝脏、肺部等功能造成永久不可逆损伤[19]，因此临床多采用医学手段延长胎儿在母体中的发育时间，并通过多次阴道检查确定胎儿发育状况，而长时间的胎膜破裂和多次阴道检查等人工干预手段显著增加了病原菌逆行感染的风险[20]。

最近的研究证实TLR4在单核细胞、巨噬细胞、绒毛膜和羊膜细胞中广泛表达，参与影响机体抗病毒感染和免疫反应的过程[21]。MyD88是一种胞质可溶性蛋白，可受TLR4调控，参与上下游信息传递过程[22]，影响疾病进展。NF-κB是细胞内调控先天性免疫应答和适应性免疫应答的关键转录因子，在多种恶性肿瘤、急慢性炎症性疾病和神经退行性疾病中异常高表达[23]。TLR4/MyD88/NF-κB信号通路作为机体识别病原体、发挥防御功能的重要通路之一，与过敏性疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的发病有关[24]。本研究结果显示，TLR4/MyD88/NF-κB通路在PPROM并发宫内感染孕妇胎盘组织中高表达，且当TLR4 mRNA表达高于13.8、MyD88 mRNA表达高于24.0、NF-κB mRNA表达高于26.6时，诊断PPROM并发宫内感染有较高的效能（P＜0.05）。TLR4可与大肠埃希菌等革兰阴性菌结合产生脂多糖，并识别白念珠菌等真菌细胞壁内的甘露聚糖等蛋白质复合物，激活MyD88信号转导途径[25]，细胞因子水平增加，进而上调NF-κB的表达，促进炎性介质等细胞因子的合成、分泌和释放，激活巨噬细胞等免疫细胞介导的炎性反应，影响机体天然免疫反应和对病原菌的易感性。因此，TLR4/MyD88/NF-κB通路的表达水平可作为反映机体免疫反应和抗病毒反应的有效标志物。

综上所述，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在PPROM并发宫内感染的孕妇胎盘组织中的表达显著升高，破膜孕周低于33周、阴道检查次数多于5次及TLR4/MyD88/NF-κB通路异常活化与PPROM并发宫内感染的发生与发展有关，可作为临床筛查和诊断PROM并发宫内感染新指标。