饲粮中添加杂交构树叶对广西三黄鸡生长性能、血清生化指标、肠道组织形态及盲肠菌群的影响

方紫依 徐百昌 蒙锦燕 崔庆含 李泓漫 司红彬

(广西大学动物科学技术学院，南宁 530004)

我国是畜牧业大国，饲料需求量大且增长迅速，然而我国的饲料原料尤其是蛋白质原料大量依赖进口，“人畜争粮”问题凸显，开发非常规的饲料资源是解决这一问题的重要手段。杂交构树(Broussonetiapapyrifera)在我国拥有广泛的种植面积，杂交构树营养成分丰富并且降解率高，是一种高营养价值的木本饲料原料[1]。农业农村部已将杂交构树纳入《饲料原料目录》并允许其用于替代猪、鸡饲粮中的部分豆粕。此外，构树叶是一种传统的中草药，《本草纲目》中记载，构树叶有凉血、利水的功效，可用于治疗吐血、血崩外伤出血、水肿、疝气、痢疾、癣疮等病症。现代药理研究证实构树及其提取物具有抑菌、抗炎、抗氧化、增强免疫力、调节血糖和血脂等功效[2]。已经研究证明构树叶对肠道健康具有一定的保护效果。唐亮[3]报道了在饲粮中添加一定比例的构树叶粉能降低生长猪的腹泻率、腹泻频率及腹泻指数。研究发现构树叶提取物对多种肠道致病菌都具有一定的体外抑制效果[4]，并且在饲粮中添加构树叶可以在一定程度上改善柔嫩艾美耳球虫造成的鸡肠道出血和肠屏障损伤[5]。广西三黄鸡作为我国重要的地方品种，在广西大范围养殖，同时广西拥有丰富的杂交构树资源，因此在饲粮中添加适宜比例的杂交构树叶不仅可以降低三黄鸡的养殖成本，还能合理地开发和利用杂交构树资源。本试验通过在基础饲粮中添加不同比例的杂交构树叶，研究其对广西三黄鸡生长性能、血清生化指标、免疫性能、肠道组织形态和盲肠菌群的影响，以确定杂交构树叶在三黄鸡饲粮中的添加比例，为杂交构树叶在畜禽生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用基础饲粮由广西某饲料有限公司提供；杂交构树叶购自广西某农民专业合作社，新鲜杂交构树叶自然晾干后粉碎过40目筛制成杂交构树叶粉，经检测其营养水平见表1。

表1 杂交构树叶粉营养水平(风干基础)Table 1 Nutrient levels of Broussonetia papyrifera leaf powder (air-dry basis) %

1.2 试验设计

选取120只健康的1日龄广西三黄鸡，随机分成4个组，每个组3个重复，每个重复10只。A组为对照组，饲喂不添加杂交构树叶的基础饲粮，基础饲粮营养水平见表2。B、C、D组分别在基础饲粮中添加3%、6%和9%的杂交构树叶粉。试验期为21 d，试验期间鸡只自由采食、饮水，按常规免疫程序进行免疫接种。

表2 基础饲粮营养水平(风干基础)Table 2 Nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.3 检测指标

1.3.1 生长性能

每天对雏鸡以重复为单位进行空腹称重，准确记录雏鸡的体重和日采食量，计算各组平均日增重(g/d)、平均日采食量(g/d)和料重比(平均日采食量/平均日增重)。

1.3.2 血清生化指标

试验第21天从每个重复分别选取5只体重接近平均体重的健康鸡，记录体重，颈静脉采血，血样室温静置1 h后3 000 r/min离心10 min分离血清。按照试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明，采用全自动血清生化仪测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性与甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量。

1.3.3 免疫器官指数

试鸡采血后分离脾脏、法氏囊、胸腺并称重，计算免疫器官指数。

免疫器官指数(%)=(免疫器官重量/体重)×100。

1.3.4 肠道组织形态

分别采集1～2 cm的十二指肠、空肠、回肠肠段，置于10%的福尔马林固定液中。将固定完全的肠道组织经过切块、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、制片、染色等一系列处理后，观察小肠黏膜结构，用Leica Qwin图像分析系统测量绒毛高度(villous height,VH)和隐窝深度(crypt depth,CD)，并计算二者的比值即绒隐比(V/C)。

1.3.5 盲肠菌群

采集2 g左右盲肠内容物于灭菌后的2 mL离心管中，液氮封存，随后转移至-80 ℃冰箱备用。分别从A组中选择3份、C组中选择6份盲肠内容物样品，选择16S rDNA的通用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)扩增V3～V4高变区，由上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rDNA测序。

1.4 数据统计与分析

试验数据以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 20.0进行单因素方差分析(one-way ANVOA)，以P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。差异显著时采用Tukey HSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 生长性能

由表3可知，与对照组相比，添加3%～9%的杂交构树叶对1～21日龄广西三黄鸡的平均日采食量无显著影响(P>0.05)，但是添加9%的杂交构树叶会显著增加料重比(P<0.05)，并显著降低平均日增重(P<0.05)。

表3 饲粮中添加杂交构树叶对广西三黄鸡生长性能的影响Table 3 Effects of dietary Broussonetia papyrifera leaves on growth performance of Guangxi Sanhuang chickens

2.2 血清生化指标

由表4可知，与对照组相比，添加3%～9%的杂交构树叶对1～21日龄广西三黄鸡血清中AST活性与TG、TC、HDL-C、LDL-C含量均无显著影响(P>0.05)，但是添加9%的杂交构树叶会显著提高血清中ALT活性(P<0.05)，提示添加过高比例的杂交构树叶可能对广西三黄鸡的肝功能造成一定的负面影响。

表4 饲粮中添加杂交构树叶对广西三黄鸡血清生化指标的影响Table 4 Effects of dietary Broussonetia papyrifera leaves on serum biochemical indexes of Guangxi Sanhuang chickens

2.3 免疫器官指数

由表5可知，与对照组相比，添加3%～9%的杂交构树叶对广西三黄鸡的胸腺指数无显著影响(P>0.05)，添加6%的杂交构树叶可以显著提高法氏囊指数(P<0.05)，而添加9%杂交构树叶则会显著降低脾脏指数(P<0.05)。

表5 饲粮中添加杂交构树叶对广西三黄鸡免疫器官指数的影响Table 5 Effects of dietary Broussonetia papyrifera leaves on immune organ indexes of Guangxi Sanhuang chickens %

2.4 肠道组织形态

由表6可知，与对照组相比，添加3%～9%的杂交构树叶对广西三黄鸡的十二指肠、空肠、回肠绒毛高度、隐窝深度以及绒隐比均无显著影响(P>0.05)。

表6 饲粮中添加杂交构树叶对广西三黄鸡肠道组织形态的影响Table 6 Effects of dietary Broussonetia papyrifera leaves on intestinal morphology of Guangxi Sanhuang chickens

2.5 盲肠菌群

2.5.1 盲肠菌群测序结果分析

如图1所示，随着测序深度与样本量的增加，样本稀释曲线均趋于平坦，结合测序覆盖深度均在0.99以上，表明本次的测序深度能基本覆盖群体的微生物多样性，满足后续分析要求。

图1 稀释曲线Fig.1 Rarefaction curve

2.5.2 盲肠菌群Alpha多样性指数分析

表7展示了盲肠菌群的Alpha多样性，其中Sobs和Chao指数可以反映微生物群落的丰富度，Shannon和Simpson指数可以反映微生物群落的多样性。与A组相比，C组的Sobs、Shannon、Simpson、Chao指数均有变化，但是差异均不显著(P>0.05)。

表7 Alpha多样性指数Table 7 Alpha-diversity indexes

2.5.3 盲肠菌群结构分析

在门水平上，A组和C组盲肠中主要菌群均为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteria)和脱硫杆菌门(Desulfobacterota)；与A组相比，C组Firmicutes、Bacteroidota的比例升高，Actinobacteriota和Desulfobacterota的比例降低。在属水平上，A组盲肠中优势菌群主要是欧氏菌属(Olsenella，31.99%)、拟杆菌属(Bacteroides，13.50%)、粪杆菌属(Faecalibacterium，7.31%)、理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group，6.99%)、另枝菌属(Alistipes，6.57%)、瘤胃球菌属扭链群(Ruminococcus_torques_group，4.80%)、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014(3.44%)和巴恩斯氏菌属(Barnesiella，3.06%)等；而C组盲肠中优势菌群主要是Alistipes(27.69%)、Ruminococcus_torques_group(15.23%)、乳杆菌属(Lactobacillus，8.41%)、Bacteroides(7.51%)、Barnesiella(6.57%)、Faecalibacterium(6.56%)和Olsenella(2.73%)等。

图2 盲肠菌群物种组成(A：门水平；B：属水平)Fig.2 Species composition of cecal microflora (A:phylum level;B:genus level)

2.5.4 盲肠菌群在属水平上的差异物种

由图3可以看出，在属水平上，与A组相比，C组的Olsenella、Rikenellaceae_RC9_gut_group、norank_f_norank_o_Gastranaerophilales、norank_f_norank_o_RF39、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、norank_f_norank_o_Rhodospirillales的比例显著降低(P<0.05)，同时Alistipes、Lactobacillus、Sellimonas、Negativibacillus、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)的比例显著升高(P<0.05)。

图3 盲肠菌群在属水平上的差异物种Fig.3 Different species at genus level of cecal microflora

3 讨 论

3.1 饲粮中添加杂交构树叶对广西三黄鸡生长性能的影响

目前构树的主要加工方式为直接干燥粉碎和青贮发酵，与干燥粉碎后直接饲喂相比较，青贮发酵需要更为专业的设备和条件控制，其中不同菌种的选择和发酵条件对发酵品质影响很大，且不利于长时间保存[6]。向饲粮中添加适当比例的构树叶粉，不仅可为家畜提供优质的蛋白质，还可替代部分饲料原料，有效控制养殖成本、提高养殖效益[1]。李艳芝[7]发现添加0.5%、1%、1.5%、2%的构树叶对产蛋中期和后期蛋鸡采食量和料蛋比的影响差异不显著，但可以提高产蛋率和蛋重。吴健平等[8]对35日龄的雌性良凤花肉鸡进行为期36 d的饲喂试验，发现添加2%～6%的构树叶粉对良凤花肉鸡的生长性能(平均日采食量、平均日增重和料重比)无显著影响。以上研究结果说明在家禽饲粮中添加一定比例的构树叶是可行的。在本研究中，饲粮中添加3%～6%的杂交构树叶对广西三黄鸡的生长性能无显著影响，而添加量增加到9%则会显著增加料重比、显著降低平均日增重；随着杂交构树叶添加比例的增高，广西三黄鸡的平均日增重及平均日采食量有所降低，可能是过高比例的添加影响了饲粮的适口性，且直接添加的杂交构树叶中含有单宁等抗营养因子，进而影响了家禽的采食和消化吸收。

3.2 饲粮中添加杂交构树叶对广西三黄鸡血清生化指标的影响

血清生化指标是反映动物机体物质代谢和某些组织器官机能变化的重要指标，其中TG、TC、HDL-C、LDL-C与机体血脂水平有关，其含量高低反映机体脂类吸收和代谢状况；ALT、AST活性可以反映肝脏合成分解代谢蛋白质的能力以及肝脏健康状况。研究显示，饲粮中添加2%～6%构的树叶粉对良凤花肉鸡血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量无显著影响，但与对照组相比TG含量有不同程度的降低[8]，本研究结果与上述报道一致。在蛋鸡中也发现添加1.5%、2%的构树叶可以显著降低血清TG含量，并且对于TC、HDL-C、LDL-C含量也有不同程度的改善作用[7]。在营养性肥胖小鼠模型中也发现添加5%的构树叶可以显著改善脂质代谢，缓解肝脏脂肪变性，减少脂肪在肝脏内的蓄积，改善肝脏功能[9]，说明添加构树叶可以改善脂质代谢。此外，饲粮中添加3%～6%的杂交构树叶对广西三黄鸡血清中ALT、AST活性无显著影响，而添加9%的杂交构树叶则会提高血清中ALT活性，提示添加过高比例的杂交构树叶可能对广西三黄鸡的肝功能造成潜在的损伤。

3.3 饲粮中添加杂交构树叶对广西三黄鸡免疫器官指数的影响

免疫器官指数在一定程度上可以反映免疫器官发育状况和机体的免疫水平。胸腺和法氏囊是禽类主要的中枢免疫器官，胸腺是T淋巴细胞发育和成熟的主要场所，主要参与机体的细胞免疫；法氏囊是B淋巴细胞发育和成熟的主要场所，主要参与机体的体液免疫；脾脏是禽类的外周免疫器官，是进行体液免疫反应和细胞免疫反应的主要场所。构树叶中含有多糖、木脂素类、生物碱类、萜类化合物等多种生物活性物质，具有增强机体免疫力等作用效果[10-11]。研究表明，添加1.5%～2%的构树叶对21日龄雏鸡胸腺、脾脏和法氏囊指数均有一定的提高作用，但是差异不显著；随着雏鸡饲喂时间的延长，尤其是49日龄后，免疫器官指数显著升高[7]。左鑫[12]发现，添加不同比例(3%、6%、9%、12%、15%)构树枝叶粉对马冈鹅的免疫器官指数也有不同程度的提高作用。本试验中，饲粮中添加3%～6%的杂交构树叶均可以在一定程度上提高广西三黄鸡的胸腺和法氏囊指数，且当添加比例为6%时可显著提高法氏囊指数，可能是因为杂交构树叶中的多糖等活性成分促进了法氏囊的发育。

3.4 饲粮中添加杂交构树叶对广西三黄鸡肠道组织形态的影响

小肠是畜禽食物消化、吸收的主要部位，也是重要的免疫和内分泌器官，主要包括十二指肠、空肠、回肠3段。肠道结构的完整是其发挥消化吸收、屏障功能的基础，其中绒毛高度、隐窝深度及绒隐比是反映肠道结构完整性和评价小肠消化吸收能力的重要指标。左鑫[12]证明了添加构树枝叶粉对鹅肠道发育有积极作用，添加3%～15%的构树枝叶粉对鹅各肠段(十二指肠、空肠、回肠)隐窝深度无显著影响。与上述报道类似，本试验结果显示，饲粮中添加3%～9%的杂交构树叶对广西三黄鸡的肠道组织形态均无不利影响。

3.5 饲粮中添加杂交构树叶对广西三黄鸡盲肠菌群的影响

肠道菌群结构与动物体的生长性能、免疫能力以及营养物质的消化吸收等直接相关。在本研究中发现，饲粮中添加杂交构树叶后，广西三黄鸡盲肠中Firmicutes和Bacteroidota的比例升高，这2种菌门是鸡盲肠的优势菌门，前者是主要的产丁酸菌，丁酸可以增强肠道的紧密连接，保护肠道屏障的完整；后者具有酵解难以分解的多糖、粗纤维等功能，能够促进物质的转化和吸收[13]；同时，饲粮中添加杂交构树叶还可以降低盲肠中有害菌群如Actinobacteriota和Desulfobacterota的比例。

进一步分析发现，在属水平上，饲粮中添加6%的杂交构树叶使广西三黄鸡盲肠中Olsenella、Rikenellaceae_RC9_gut_group、norank_f_norank_o_Gastranaerophilales、norank_f_norank_o_RF39、Desulfovibrio、norank_f_norank_o_Rhodospirillales的比例显著降低。Olsenella和norank_f_norank_o_RF39比例与体重增加呈负相关[14-15]，而在本试验中饲粮中添加6%的杂交构树叶后平均日增重却有所下降，推测可能是直接添加杂交构树叶降低了饲粮的适口性以及杂交构树叶中的抗营养因子影响了广西三黄鸡的消化吸收；Rikenellaceae_RC9_gut_group与高脂饮食引起的“有害指标”呈正相关，与“有益指标”呈负相关[16]。norank_f_norank_o_Gastranaerophilales被报道与糖尿病有关，在糖尿病小鼠的粪便中该菌的数量显著增多[17]；Desulfovibrio是典型的硫酸盐还原菌，该菌可以降解短链脂肪酸和氨基酸等物质产生硫化氢，进而引起上皮细胞的损伤[18]。norank_f_norank_o_Rhodospirillales在肝郁脾虚患者粪便中丰度明显偏高[19]，也有研究表明该菌和蛋白质的分解以及氨基酸的合成有关[20]。通过添加杂交构树叶可以减少上述可能会损害肠道健康的菌群的数量。

同时，饲粮中添加6%的杂交构树叶后，广西三黄鸡盲肠中Alistipes、Lactobacillus、Sellimonas、Negativibacillus、Anaerostipes的比例显著升高。其中Alistipes、Lactobacillus和Anaerostipes是产生短链脂肪酸的常见肠道菌群，产生的乙酸等可以降低肠道的pH，从而抑制肠道有害菌的生长，促进有益菌的生长，起到调节肠道功能的作用[21-23]。研究表明Lactobacillus可作为免疫增强剂提高鸡法氏囊B淋巴细胞的增殖活性，加快法氏囊的发育成熟，从而提高法氏囊指数[24]。Negativibacillus被报道与日增重呈正相关，并且可能和免疫力相关[25-26]，而饲喂添加6%杂交构树叶饲粮的广西三黄鸡的体重并没有明显的增加，推测可能是杂交构树叶的添加降低了饲粮的适口性及其所含的抗营养因子影响了机体的消化吸收。此外，在本研究中发现，饲粮中添加6%的杂交构树叶后广西三黄鸡盲肠中Sellimonas的比例也显著增加，该菌的丰度在添加复合益生菌的雏鸡盲肠中也增加[27]，但是其具体的功能还不清楚。总体来说，饲粮中添加6%的杂交构树叶增加了广西三黄鸡肠道中益生菌的数量，抑制了有害菌的增殖，调节了肠道菌群的结构，能够更好地维持肠道健康。

4 结 论

综上所述，饲粮中添加3%～6%的杂交构树叶对广西三黄鸡的生长性能、血清生化指标和肠道组织形态无显著影响；添加6%的杂交构树叶可以显著提高广西三黄鸡的法氏囊指数，改善盲肠菌群结构，在提高部分有益菌数量的同时抑制有害菌增殖；添加9%的杂交构树叶则会提高血清中ALT活性，提示添加过高比例的杂交构树叶可能对广西三黄鸡的肝功能造成一定的损伤。基于本研究结果，推荐广西三黄鸡饲粮中杂交构树叶的添加比例为6%。