顺式-草酸-二霉酚酸-(反式-1,2-环己烷二胺)合铂(Ⅳ)的合成、表征及抗肿瘤活性

刘其星, 王应飞, 谢丽娇, 丛艳伟, 曾 艳, 孙明能, 沈庆飞

(1. 昆明贵研药业有限公司,云南 昆明 650106; 2. 云南师范大学 职业技术教育学院,云南 昆明 650500)

铂类抗癌药作为化疗体系中的一大分支,对睾丸癌、卵巢癌、结肠直肠癌和非小细胞肺癌等实体肿瘤的治疗效果,显现出优于其它化学药物的特性,对改善癌症患者的生活质量及延长寿命起到了积极作用[1-4]。目前,已获批准上市的铂类抗癌药包括顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂、庚铂和米铂(图 1)。值得注意的是,上述铂类抗癌药均为二价经典构型的铂配合物,存在毒副作用大、耐药性和剂量限制等缺陷。产生该缺陷的原因在于铂类药物属于细胞毒类化合物,对癌细胞缺乏足够的选择性,在杀死癌细胞的同时,亦对正常细胞起到杀伤作用,导致受体表现出感觉异常、恶心、呕吐、脱发和变态性发热等症状,进而使药物用量受限。此外,癌细胞先天或后天对铂类药物不敏感,是产生耐药性的重要原因。

图1 已批准上市的铂类抗癌药

为克服或弥补此类缺点,研究人员陆续开发了一系列新型铂配合物药物,如具有空间位阻的铂配合物[5-7]、具有生物活性配体的铂配合物[8-10]、单官能团铂配合物[11-13]、具有反式几何结构的铂配合物[14-16]、多核铂配合物[17-19]以及四价铂配合物[20-22]等。其中,四价铂配合物可在轴向位置引入新的配体,允许进一步的化学修饰和调整性质,且该类铂配合物稳定性良好、可口服、不易与蛋白质发生反应、毒副作用小且可靶向给药[23],成为近年来铂类抗肿瘤药物的研发热点[24-25]。

研究表明[26-27],奥沙利铂对癌细胞的作用机理不同于顺铂和卡铂,它能够引起核糖体生物及核仁发生应激,从而表现出不同的临床应用和副作用。奥沙利铂还可诱导免疫原性细胞凋亡,这与其治疗高度相关[28];在缺乏TLR4基因片段的结直肠癌患者中,奥沙利铂的抗癌效果较差[29]。因此,免疫系统的调节将影响奥沙利铂的抗癌作用。

霉酚酸酯作为一种主要的免疫抑制剂,已被国内外广泛用于预防和治疗移植器官急性排斥反应[30-31]。鉴于霉酚酸具有优良的免疫系统调节能力,在对奥沙利铂进行氧化制成四价铂配合物时,对其轴向两端分别引入霉酚酸,有望获得新的铂配合物,既能保存奥沙利铂本身对大肠癌、卵巢癌和非小细胞肺癌等的较好疗效,又能在治疗过程中发挥霉酚酸具有的免疫抑制活性,使之成为一种潜在的铂类抗癌新药。

本文设计并合成了一种新型铂(Ⅳ)配合物——顺式-草酸-二霉酚酸-(反式-1,2-环己烷二胺)合铂(Ⅳ)(图2),采用元素分析、质谱、红外光谱和核磁共振表征了配合物的组成和化学结构,并采用溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)比色法对目标化合物进行抗肿瘤活性评价。

图2 顺式-草酸-二霉酚酸-(反式-1,2-环己烷二胺合铂(Ⅵ)的合成路线

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司);AutoSpec 3000型质谱仪(美国Waters公司);Bruker Avance DRX 500型核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司);Vario EL Ⅲ型元素分析仪(德国Elementar公司);Nicolet iS5型傅里叶变换红外光谱仪(美国赛默飞世尔科技公司);Aeries型X-射线衍射仪(荷兰帕纳科公司)。

奥沙利铂(纯度≥99%,昆明贵研药业有限公司);苯并三唑四甲基四氟硼酸(TBTU,吉尔生化(上海)有限公司);三乙胺,98%霉酚酸(阿拉丁试剂(上海)有限公司);30%过氧化氢,DMF,甲醇(天津市风船化学试剂科技有限公司);丙酮,乙醚,乙醇(云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司);纯水(昆明贵研药业有限公司自制),若无特殊说明,所有药品皆为分析纯。

1.2 顺式-草酸-二霉酚酸-(反式-1,2-环己烷二胺)合铂(Ⅳ)的合成

向1000 mL圆底烧瓶中加入奥沙利铂10.00 g(25.19 mmol)和纯水800 mL,于70 ℃避光搅拌20 min;缓慢加入30%双氧水15 mL,加毕,反应4 h。冰水浴冷却1 h,过滤,固体物依次用纯水洗涤3次,用乙醇洗涤1次,于80 ℃干燥至恒重得Ⅳ 9.51 g(22.06 mmol),收率87.60%。

取Ⅳ 5.00 g(11.60 mmol)、 DMF 300 mL,于60 ℃避光搅拌30 min至溶清;缓慢加入霉酚酸11.22 g(35.06 mmol)、三乙胺3.53 g(34.95 mmol)和TBTU 11.25 g(35.05 mmol),充分搅匀,反应72 h。浓缩,剩余物加入甲醇-丙酮混合液1000 mL(甲醇∶丙酮=1∶1,V∶V),充分搅拌,静置、过滤,固体物用纯水洗涤、滤干得粗产物。将全部粗产物移入100 mL乙醚溶剂中,于30 ℃搅拌10 min;过滤,滤液缓慢移入甲醇-丙酮混合液1000 mL(甲醇∶丙酮=1∶4,V∶V),过滤,固体物用纯水洗涤、滤干,于80 ℃干燥至恒重得Ⅳ 4.31 g,收率35.90%(以奥沙利铂计),含量96.58%;1H NMRδ: 9.37～9.36(s, 2H, 2OH of 2C17H19O6), 8.31～8.30(s, 2H, 2CH of 2C17H19O6), 5.24(s, 4H, 2CH2of 2C17H19O6), 5.13～5.11(t, 2H, 2CH of C6H14N2), 3.69(s, 6H, 2CH3of 2C17H19O6), 3.28～3.27(s, 4H, 2CH2of 2C17H19O6), 2.48～2.47(s, 4H, 2CH2of 2C17H19O6), 2.31～2.28(t, 4H, 2CH2of 2C17H19O6), 2.11～2.08(t, 6H, 2CH3of 2C17H19O6), 2.07(s, 4H, 2CH2of C6H14N2), 1.70(s, 6H, 2CH3of 2C17H19O6), 1.48～1.36(d, 4H, 2NH2of C6H14N2), 1.18～1.08(m, 4H, 2CH2of C6H14N2);13C NMRδ: 180.85(C-1″, 1‴), 170.60(11″, 11‴-COO), 163.87(C-1′, 2′), 163.01(C-8″, 8‴), 153.14(C-12″, 12‴), 146.29(C-10″, 10‴), 134.35(C-4″, 4‴), 123.06(C-5″, 5‴), 122.87(C-7″, 7‴), 116.46(C-9″, 9‴), 107.46(C-11″, 11‴), 69.08(10″, 10‴-CH2O), 61.13(8″, 8‴-OCH3), 46.23(C-3″, 3‴), 40.49(C-2″, 2‴), 35.50(C-1, 2), 31.38(C-3, 6), 23.95(C-4, 5), 22.87(C-6″, 6‴), 16.43(4″, 4‴-CH3), 11.53(9″, 9‴-CH3); IRν: 3445(OH), 3189(NH2), 2925(CH3), 2870(CH2), 1600(C=C), 1376(COO), 1172(C—C), 1111(C—O—C), 720(Pt—N), 449(Pt—O)[32-33]; HR-MS(ESI)m/z: [C42H52N2O16Pt+Na]+=1058.2879(100%), 1059.2891(94.6%), 1057.2856(63.2%), 1060.2913(37.7%), 1061.2910(21.9%), 1062.2930(11.6%); Anal.calcd for C42H52N2O16Pt: C 48.70, H 5.06, N 2.70, Pt 18.83, found C 48.57, H 4.99, N 2.78, Pt 18.88。

1.3 体外抗癌活性测试

采用溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)比色法测试了Ⅳ对SW480人体结肠癌细胞株、HCT-116人体结直肠癌细胞株、A2780人体卵巢癌细胞株、A549人体非小细胞肺癌细胞株和U-2OS人体骨肉瘤细胞株的体外抗癌活性。

对所选用的细胞株均培养在含有10%胎牛血清的RPMI-1640生长培养基中,培养条件为饱和湿度、37 ℃、 5% CO2环境。取对数生长期的细胞于96孔细胞培养板中,调整细胞密度,使每孔约含有4000～6000个细胞。孔板中设加药、对照(只加细胞不加药物)和空白(只加无细胞培养液)3组,其中加药组中以顺铂、赛特铂为阳性对照,培养24 h贴壁。当测试时将完全培养基稀释成所需浓度,DMSO终浓度不超过0.1%,每个浓度设5个复孔。加药后(新型铂配合物提前溶解于DMSO溶剂中)再将细胞放回原培养环境中继续培养48 h,加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT孵育4 h,吸去液体,加入150 μL的DMSO溶剂,使甲瓒完全溶解。30 min内,用酶标仪在490 nm波长下测定OD值,并计算抑制率。试验平行进行3次,根据抑制率采用非线性回归方法计算半抑制率IC50值。

2 结果与讨论

2.1 合成条件分析

本文以奥沙利铂为起始物料,在双氧水的氧化下,于奥沙利铂轴向两端成功引入羟基,制得中间体顺式-草酸-二羟基-(反式-1,2-环己烷二胺)合铂(Ⅳ)。再将此中间体于DMF中溶解,以霉酚酸为反应原料、三乙胺为催化剂、TBTU为偶联剂,成功将霉酚酸引入奥沙利铂轴向两端,形成霉酚酸酯,制得目标化合物Ⅳ。

在前期研究中,发现第二步反应中使用的DMF与DMSO均有相似的溶解能力,进一步考察,发现在后续的浓缩环节时,DMSO本身具备的的高沸点及吸潮性增大了低压浓缩除去DMSO的难度,因此,仍选用DMF溶剂。经过一段时间的反应,制得目标化合物母液,再根据不同溶剂的极性差异,顺利地制备出具有较高含量目标化合物的样品。

2.2 体外抗癌活性评价

根据制得的新型铂配合物结构,以及该结构中含有的霉酚酸在骨肉瘤中潜在的应用前景[34],故选择1株人体结肠癌细胞株(SW480)、 1株人体结直肠癌细胞株(HCT-116)、 1株人体卵巢癌细胞株(A2780)、 1株人体非小细胞肺癌细胞株(A549)和1株人体骨肉瘤细胞株(U-2OS)为细胞模型,采用MTT法来评价目标化合物的抗肿瘤细胞增值活性,根据抑制率计算半数抑制浓度IC50值,结果见表1。

表1 目标化合物的生物活性

从表1中可以看出,目标化合物对选定的SW480、 HCT-116、 A2780和U-2OS肿瘤细胞株的增殖均有良好的抑制活性,IC50均小于10 μmol/L,与奥沙利铂接近。

本文设计、合成了一种新型铂(Ⅳ)配合物—顺式-草酸-二霉酚酸-(反式-1,2-环己烷二胺)合铂(Ⅳ),并评价了其体外抗癌活性。结果显示:目标化合物的效果与奥沙利铂相当,且表现出良好的抑制人体骨肉瘤细胞U-2OS增殖的活性。