补阳还五汤通过PI3K/AKT通路调控自噬抗大鼠脑缺血/再灌注损伤的作用

单玉栋，赵艳萌，靳晓飞，周晓红，叶佳蓓，马秀娟，田 甜，蔡国英，高维娟

(河北中医学院，河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北 石家庄 050091)

脑卒中是人类第二大死亡原因，也是导致残疾的主要原因，给家庭与社会造成巨大的经济损失，缺血性脑卒中是其最常见的类型之一[1]。因此，更有效的防治缺血性脑卒中是迫切需要解决的重要问题。由动脉闭塞引起的缺血性卒中，通过静脉溶栓和血管内血栓清除术进行快速再灌注是治疗的重点。中医认为，缺血性脑卒中属于“中风”范畴，气虚血瘀是其根本病因，补气活血化瘀是治疗要义。在治疗上与现代医学有异曲同工之妙。

中医药是治疗脑卒中的重要疗法之一，补阳还五汤是治疗缺血性脑卒中和卒中致残的经典方剂，已经有数百年的历史。补阳还五汤出自清·王清任的《医林改错》，方名寓含治法，是补气活血的代表方剂之一。从中医的观点来看，该汤用于改善经络气血，促进血液循环，广泛应用于缺血性脑卒中的临床防治。已有文献[2]及本课题组前期研究表明，补阳还五汤通过调节自噬减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤，但其具体作用机制尚待进一步探究。

研究表明PI3K/AKT通路对脑缺血/再灌注后的细胞存活至关重要[3]。因此，本研究将通过大鼠大脑中动脉阻塞再灌注(middle cerebral artery occulusion/ reperfusion,MCAO/R)模型为研究对象，探讨补阳还五汤是否通过PI3K/AKT通路调控自噬起到神经保护作用。

1 材料

1.1 实验动物♂，体质量(220～250)g，SPF级，SD大鼠50只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)2016-0011。本实验经河北中医学院伦理委员会批准(批准文号：DWLL2020075)，所有操作符合实验动物伦理要求。

1.2 主要试剂与耗材PI3K通路抑制剂LY294002(HY-10108)购自MCE公司；p62抗体(18420-1-AP)购自Proteintech公司；β-actin抗体(23660-1-AP)购自Proteintech公司；SDS-PAGE试剂盒、Cy3标记山羊抗兔IgG(A0516)、抗荧光淬灭封片液含DAPI(P0131)购自beyotime公司；LC3B抗体(L7543)购自SIGMA公司；LC3B抗体(ZRB100)购自SIGMA公司；PI3K抗体(4249S)、AKT抗体(4691S)、p-AKT抗体(4060S)购自CST公司；苏木精染液(G1004-100ML)、伊红染液(G1001-100ML)、TTC(G1017)购自servicebio公司；MCAO线栓(2636-A3)购自北京西浓公司；黄芪120 g，当归6 g，地龙3 g，川芎3 g，赤芍5 g，桃仁3 g，红花3 g，购自北京同仁堂有限公司后本课题组进行液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术，检测补阳还五汤中黄芪甲苷含量为0.133 mg·g-1生药、毛蕊异黄酮苷含量为0.139 mg·g-1生药、芍药苷含量为0.492 mg·g-1生药、阿魏酸含量为0.04 mg·g-1生药并做成冻干粉。

1.3 主要仪器51700全自动脑立体定位仪(Stoelting公司)；EG11508组织包埋机(Leica公司)；RM2255全自动轮转切片机(Leica公司)；DM5000B光学显微镜(Leica公司)；THUNDER免疫荧光显微镜(Leica公司)；Fusion FX5 Spectra成像系统(Vilber公司)；Varioskan LUX多功能微孔板读数仪(Thermofisher公司)，恒压电泳仪及转膜仪(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 动物分组、动物模型制备及脑室内注射随机将50只SD大鼠分为假手术组(Sham)10只、模型组(Model)10只、补阳还五汤组(BYHWD)10只、PI3K抑制剂组(LY294002)10只与溶媒剂组(Vehicle)10只。补阳还五汤组大鼠造模完成后，应用补阳还五汤冻干粉3.02 g·kg-1·d-1灌胃处理。大鼠MCAO/R模型制备参照本课题组前期基础[4-5]，1%戊巴比妥钠(50 mg·kg-1)麻醉，在颈前横过矢状面做中线切口，结扎颈外动脉远端。4-0单丝尼龙线结扎颈外动脉近端，并将多聚赖氨酸包被的线栓经颈内动脉送入大脑中动脉，MCAO 2 h后撤回线栓并结扎端口。72 h后进行各项检测。手术全过程使用加热垫，使大鼠保持37 ℃肛温。

LY294002溶于DMSO后加入Tween-80助溶，后用生理盐水稀释到20 μmol·L-1，MCAO造模前30 min取5 μL进行脑立体定位注射[6]。在颅骨钻孔，将10 μL Hamilton注射器的针头经颅骨钻孔插入左侧脑室。定位注射参数[7]：以前囟为坐标零点定位，AP为0.8 mm；ML为1.4 mm；DV为3.6 mm，1 μL·min-1注射完毕后留针15 min拔针，消毒缝合。

2.2 大鼠神经功能学评分采用盲法对各组大鼠进行Zea longa[8]评分：无神经功能损伤0分；不能完全伸展对侧爪1分；向手术对侧转圈2分；向手术对侧倾倒3分；意识丧失4分。选择1～3分大鼠入组。

2.3 脑梗死体积测定断头取脑，-20 ℃中冷冻30 min，切成冠状面切片，厚度2 mm。放入小培养皿中，37 ℃ 0.5% TTC避光孵育20 min，中途翻面1次，吸出多余的TTC，放入4%多聚甲醛中固定24 h后拍照。梗死体积/%=(正常侧半脑面积-梗死侧正常面积)/2×正常侧半脑面积×100%[9]。

2.4 HE染色观察脑组织病理损伤大鼠麻醉后，心脏灌流快速取脑。4 ℃中性甲醛固定48 h，石蜡包埋，行冠状切片，厚5 μm。进行HE染色，光学显微镜下拍照，观察脑组织IP神经细胞的损伤情况。

2.5 免疫荧光检测LC3B表达石蜡切片常规脱蜡、脱水、抗原修复、双氧水封闭。免疫染色封闭液封闭15 min，LC3抗体(1 ∶200)4 ℃过夜。Cy3标记山羊抗兔IgG(1 ∶500)37 ℃避光孵育1 h，封片液封片。Leica荧光显微镜拍摄图片并分析荧光强度。

2.6 Western blot检测相关蛋白提取大鼠缺血侧半暗带蛋白，测定组织蛋白浓度。将蛋白经SDS-PAGE分离湿转至PVDF膜，5%牛血清白蛋白室温封闭，将膜与一抗LC3(1 ∶1 000)、p62(1 ∶2 000)、PI3K(1 ∶1 000)、p-AKT(1 ∶2 000)、AKT(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜，二抗(1 ∶20 000)37 ℃孵育1 h，混合ECL A/B液，置于多功能成像系统中显影，用软件对条带灰度值进行分析。

3 结果

3.1 补阳还五汤对神经功能缺损的影响与Sham组比较，大鼠MCAO/R后，Model组神经功能缺损明显(P<0.01)；与Model组比较，BYHWD组神经功能缺损明显改善(P<0.05)；BYHWD改善神经功能缺损的作用被LY294002降低(P<0.05)；BYHWD组与Vehicle组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见Fig 1。

3.2 补阳还五汤对脑梗死体积的影响与Sham组比较，大鼠MCAO/R后，Model组脑梗死体积明显增加(P<0.05)；与Model组比较，BYHWD组脑梗死体积明显缩小(P<0.05)；BYHWD降低脑梗死体积的作用被LY294002所减弱(P<0.05)；BYHWD组与Vehicle组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见Fig 2。

Fig 1 Neurological scores of each 1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.##P<0.01 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

3.3 补阳还五汤对脑组织缺血半暗带病理损伤的影响Sham组大鼠脑组织IP形态结构正常，细胞形态清晰，结构致密，核仁清晰；Model组脑组织IP空泡化严重，大量神经元丢失和死亡，部分核溶解和凝聚；与Model组比较，BYHWD组大鼠脑组织IP损伤情况明显缓解；BYHWD改善大鼠脑组织IP病理损伤的作用被LY294002所抑制；BYHWD组与Vehicle组比较无差异，Fig 3。

3.4 补阳还五汤对大鼠脑组织LC3B免疫荧光表达的影响大鼠MCAO/R后，与Sham组比较，Model组大鼠脑组织LC3B荧光表达升高(P<0.05)；与Model组比较，BYHWD组大鼠脑组织LC3B荧光表达降低(P<0.05)；BYHWD降低大鼠脑组织LC3B荧光强度的作用被LY294002所减弱(P<0.05)；BYHWD组与Vehicle组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见Fig 4。

Fig 2 Representative pictures of TTC staining and relevant quantitative 1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.A:Representative pictures of brain sections stained with TTC;B:Percentage of volume.#P<0.05 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

Fig 3 HE staining of brain tissues in each group of rats(Scale=50 μm)Representative images of HE staining in the rat cerebral ischemic penumbra.A:Sham;B:Model;C:BYHWD;D:BYHWD+LY294002;E:BYHWD+Vehicle.

3.5 补阳还五汤对各组PI3K，p-AKT，AKT蛋白表达的影响大鼠MCAO/R后，相对于Sham组，Model组通路蛋白PI3K与p-AKT/AKT表达明显降低(P<0.05)；与Model组比较，BYHWD组通路蛋白PI3K与p-AKT/AKT表达明显升高(P<0.05)；BYHWD的调控作用被LY294002所抑制(P<0.05)；BYHWD组与Vehicle组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见Fig 5。

3.6 补阳还五汤对各组自噬标志蛋白LC3、p62的影响Sham组比较，Model组LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高，p62表达降低(P<0.05)；与Model组比较BYHWD组LC3Ⅱ/Ⅰ表达降低，p62表达升高(P<0.05)；BYHWD降低LC3Ⅱ/Ⅰ与升高p62表达的作用被LY294002所减弱(P<0.05)；BYHWD组与Vehicle组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见Fig 6。

4 讨论

缺血性脑卒中是临床常见病，当大脑某个区域的血液供应因栓塞或血栓而突然中断，进而导致相应的神经功能障碍甚至脑细胞死亡时，就会发生缺血性脑卒中。缺血性脑卒中患者最初的临床缺陷很大程度上是由大脑中低灌流、生物电异常的缺血性半暗带所致[10]。随着时间的推移，这一区域逐渐转化为不可逆转的损伤组织即缺血核心区。因此，梗死组织半暗带恢复再通是治疗首选，但脑缺血/再灌注会引发一系列生化和细胞损伤。

细胞自噬是脑缺血/再灌注后细胞死亡的重要途径之一。自噬是一种自我保护的细胞分解代谢途径，通过该途径，不需要的蛋白质被降解成代谢元素，并被循环利用，进而维持细胞自身的动态平衡和其正常生命活动[11-12]。在分子角度上，自噬主要由多个自噬相关基因(Atg)执行，同时也受多种信号网络调节。自噬小体的形成过程需要两个泛素样蛋白Atg12和Atg8，LC3-Ⅰ存在于胞质中，是Atg8蛋白家族中最具特征性的成员。在磷脂酰乙醇胺参与下LC3-Ⅰ偶联形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ参与自噬体膜的形成，因此LC3Ⅱ/Ⅰ的变化反应自噬程度[13]。p62(也称SQSTM1蛋白)是负责溶酶体降解的自噬适配器，可以被自噬机制识别，运送到溶酶体并进行降解，故自噬发生时p62含量下降[14]。有研究表明[15-16]基于自噬的PI3K/AKT通路在脑缺血/再灌注损伤中扮演着重要的角色。

Fig 4 Representative immunofluorescence staining images of LC3B in each group n=3)1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.A:Representative immunofluorescence staining images of LC3B in each group B:Analysis of LC3B mean fluorescence intensity of each group.#P<0.05 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

Fig 5 The protein expressions of PI3K,p-AKT and AKT in each n=3)1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.A:Representative Western blot images of PI3K,p-AKT and AKT levels.B:PI3K and p-AKT/AKT expression.#P<0.05 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

Fig 6 The protein expressions of LC3Ⅰ,LC3Ⅱ and p62 in each n=3)1：Sham；2：Model；3：BYHWD；4：BYHWD+LY294002；5：BYHWD+Vehicle.A:Representative Western blot images of LC3Ⅰ,LC3Ⅱ and p62 levels.B:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio.C.p62 expression.#P<0.05 vs Sham,*P<0.05 vs Model,^P<0.05 vs BYHWD and BYHWD+Vehicle.

本研究以大鼠MCAO/R模型，模拟脑缺血/再灌注过程。实验结果表明补阳还五汤能够改善大鼠脑缺血/再灌注引起的损伤，同时能够使PI3K，p-AKT/AKT，LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高，使p62表达降低。而LY294002能够减弱补阳还五汤的保护作用。综上所述，补阳还五汤能够通过激活PI3K/AKT通路抑制自噬抗大鼠脑缺血/再灌注损伤。