单增李斯特菌对小鼠机体机能的影响

文│毛志福（昌吉州农产品质量安全中心）

刘耀阳（石河子大学动物科技学院）

李斯特菌（Listeria Monocytogenes，LM）又被称为单核球增多性李斯特菌、李氏菌，是以约瑟夫李斯特的一个大名符号来进行命名的。兼性厌氧细菌，革兰氏阳性，属厚壁菌门。LM 基因组中存在多个毒力因子基因簇，其中毒力岛4（Listeria monocytogenes pathogenicity island 4，LIPI-4）所编码的蛋白在抑制药物合理使用和抑制人体对抗病毒感染发病的整个反应过程起到了重要作用。笔者通过病理组织学观察，进一步阐述单增李斯特菌亲本株和LIPI4缺失株对机体造成的病例反应和临床表现，为深入研究载体致病发生机制和特种疫苗应用载体研发提供一定理论依据。

一、试验动物与菌种

5周龄昆明系小白鼠20只、单增李斯特菌、缺失LIPI-4的李斯特菌（来源石河子大学动物科技学院病理实验室）。

二、试验方法

1.细菌培养。将李斯特菌在增菌固体琼脂上37℃，培养24小时，挑取单个菌落，37℃、200转/分钟，培养24小时。反复挑菌增菌培养，直到固体培养基长出大小均匀，形状相同的菌落，再进行纯化、感染小鼠。

2.小鼠感染。将小白鼠分成两组（A、B），每组10只，A组每只小白鼠于腹腔接种约108国际单位/毫升的LIPI-4缺失李斯特菌；B组小白鼠注射等量的单增李斯特菌细菌，同样条件饲喂。

3.组织采集。分别在感染后的24、48、72、96、120小时后，同时解剖两组小鼠并采集的脑、肝、脾组织制作切片。

4.制作切片。采样的组织用福尔马林固定、石蜡切片制作、HE染色、显微镜观察。

三、试验结果

1.脑组织切片。观察显示：LIPI-4缺失李斯特菌（A组）感染24小时，脑组织切片未见异常。单增李斯特菌亲本株（B组）感染24小时，脑组织部分脑膜血管及脉络丛血管扩张，内充满红细胞，血管外围也有红细胞；感染72小时脑组织部分小血管外围和部分神经元外围有较大间隙。

2.肝组织切片。观察显示：LIPI-4缺失李斯特菌（A组）感染48～96小时肝组织表现正常。单增李斯特菌亲本株（B组）感染后48小时，肝组织大部分小叶中央静脉扩张；感染后72小时，肝组织个别视野可见数个蓝染区域，区域内肝组织结构消失，内有中性粒白细胞及坏死崩解的中性粒白细胞碎片，及淋巴细胞和坏死的肝细胞；感染后96小时，肝组织个别视野可见淡染区，淡染区内肝细胞核溶解消失；感染120小时，肝组织部分区域小叶中央静脉及窦状隙充满红细胞。

3.脾组织切片。观察显示：LIPI-4缺失李斯特菌感染后24、72、96小时，均显示脾组织内部分脾小结体积增大，淋巴细胞数量明显增多，但脾小体轮廓清晰，未出现淋巴细胞溶解等现象。单增李斯特菌亲本株（B组）感染后72小时，脾部分脾小结内出现淡染区，淡染区内淋巴细胞核溶解、消失；感染后96小时，脾大部分脾小体轮廓不清晰，出现淡染区，淋巴细胞核完全溶解、消失。

四、结果分析

1.单增李斯特菌亲本株感染的脑、肝、脾组织。在腹腔注射单增李斯特菌亲本株后，观察不同时间病理组织切片发现，单增李斯特菌亲本株感染24小时后脑呈现出部分脑膜血管及脉络丛血管扩张，内充满红细胞，血管外围也有红细胞。单增李斯特菌亲本株感染72小时后脑呈现部分小血管外围和部分神经元外围有较大间隙。由此可以得出结论，单增李斯特菌亲本株对小鼠脑有较大影响，可引发急性脑炎等疾病。

在感染后48小时，肝呈现大部分小叶中央静脉扩张，72小时后肝呈现数个化脓灶，96小时后肝呈现为个别可见淡染区，淡染区内肝细胞核溶解消失，120小时后肝呈现部分区域小叶中央静脉及窦状隙充满红细胞。由此可以得出结论，单增李斯特菌亲本株对小鼠的肝有较大影响，会使肝细胞核溶解，引起化脓性肝炎等疾病。

在感染后72小时，脾表现为部分脾小结内有淡染区，淡然区内淋巴细胞核溶解、消失；96小时后脾表现为大部分脾小体出现淡染区，淡染区淋巴细胞核溶解，消失，说明该处的T淋巴细胞出现变性、坏死现象，所以单增李斯特菌亲本株感染会引起坏死性脾炎，主要是细胞免疫反应受到损伤。

2.LIPI-4缺失李斯特菌感染后感染的脑、肝、脾组织。LIPI-4缺失李斯特菌感染后24～48小时，脑组织和肝组织未见异常。感染后96小时肝呈现部分区域淡染，但区域内肝组织结构清晰，肝细胞、中性粒、白细胞、淋巴细胞均未见坏死溶解现象，说明LIPI-4缺失李斯特菌对机体无损伤。

感染后24小时，脾表现为部分脾小体体积增大，该处淋巴细胞数目明显增多，主要体现了T淋巴细胞参与的细胞免疫反应，感染后72、96小时，脾未见异常，说明LIPI-4缺失李斯特菌，机体产生了细胞免疫，单位对机体重要组织产生损害。

五、结论

通过观察到的切片可以发现，单增李斯特菌亲本株可以引起脑炎、化脓性肝炎、坏死性脾炎、破坏淋巴细胞，影响细胞免疫反应。LIPI-4缺失的李斯特菌感染小鼠后，小鼠的脾和肝都呈现出正常，说明缺失LIPI-4基因片段后的李斯特菌对于肝和脾的损伤显著降低，对于机体机能基本无影响。李斯特菌的LIPI-4基因片段的表达对其致病性和李斯特菌在细胞内增值有着较大影响。有研究表明，组成LIPI-4的6个基因涉及20多种不同生物细胞碳水化合物和糖醇的磷酸化和糖醇以及跨磷酸酶的多种膜透和活性磷酸转运，李斯特菌可以通过LIPI-4调节细菌迁移速率及细胞内增值而降低细菌毒力。试验中缺失株感染后小鼠脾小体体积增大可以得出，说明小鼠机体内的免疫反应主要由T淋巴细胞参与，表明在一定程度上可以刺激机体产生细胞免疫。

单增李斯特菌可通过动物口腔、食物接触到动物粪便的多种途径可以进行感染传播，对人类和动物都易感。临床表现为脓毒症，脑膜炎，病理表现为单核细胞增多。该细菌在4℃时能够健康存活并繁殖，是通过冷藏食品而导致食源传染性疾病的主要原因之一，因此，食品行业监管部门应加强对食品卫生微生物学检测，尤其是半开放包装且需长期存放或运输的食品。在人们日常生活中，用冰箱长期冷冻生肉、海鲜，4℃冷藏即食熟食或剩菜剩饭等经常出现，这也大大增加了李斯特菌的感染风险。

李斯特菌是一种胞内寄生菌，从细胞反应机理来看，机体被感染后，单增李斯特菌紧黏在巨噬细胞和肠细胞上并进入细胞内，使细胞出现增生，释放细菌性质过氧化物歧化酶，来对抗活化巨噬细胞内的各种过氧化物对其的分解，同时产生溶血素（即李氏杆菌溶血素O），对机体组织产生损害。感染后的机体主要依靠自身的免疫细胞和免疫抑制功能进行免疫消除。而LIPI4是单增李斯特菌的毒力基因。因此，构建LIPI4基因缺失株作为新的优良流感疫苗注射载体研发打下重要基础。