贵州百香果病毒病病原的鉴定

任羽羽，王立娟，陈 楠，袁启凤，马玉华

(1.贵州省农业科学院，贵州 贵阳 550006；2.贵州省果树科学研究所，贵州 贵阳 550006；3.贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025)

0 引言

【研究意义】百香果(PassifloraeduliaSims)又称鸡蛋果，是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(Passiflora)的多年生藤本植物[1-3]。其原产于热带地区，我国台湾地区最早引入，近年来在广东、广西、福建、海南、四川和贵州等地均有种植[4]。百香果营养丰富，兼具食用和药用功能，深受大众喜爱。百香果具有当年种植当年结果的优势，因而经济价值高[5]。当前生产上百香果主要为无性繁殖，苗木多为外地引种栽培，导致多种病毒累积，致使果实品质下降以及产量降低。鉴定贵州百香果的病毒病病原种类，有助于了解侵染贵州百香果主要病毒的种类和建立有效的分子检测体系，对后期病毒检测和防控意义重大。【前人研究进展】目前，国内外已报道8个属32种侵染百香果的植物病毒，分别为马铃薯Y病毒属(Potyvirus)、黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)、菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)、柑橘粗糙病毒属(Cilevirus)、芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)、香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)和线虫传多面体病毒属(Nepovirus)[6]。我国主要报道了10种可侵染百香果的病毒，我国台湾地区最早在百香果种植地检测出大戟曲叶病毒(Euphorbialeafcurlvirus,ELCV)和广东番木瓜曲叶病毒(PapayaleafcurlGuangdongvirus,PaLCuGdV)2种双生病毒属病毒[7]；福建和广西等地检测到的百香果病毒主要有黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、夜来香花叶病毒(Telosmamosaicvirus,TeMV)和东亚西番莲病毒(EastAsianPassifloravirus,EAPV)[8-11]；广东地区主要检测到西番莲斑驳病毒(Passionfruitmottlevirus,PaMV)[12]；2017—2018年对贵州2个百香果品种进行病毒鉴定，检测结果为CMV和TeMV[13]。【研究切入点】近3年来，随着贵州百香果产业规模快速扩大和品种呈现多元化，针对贵州百香果病毒检测的相关报道较少，因此有必要继续开展病毒鉴定。【拟解决的关键问题】应用去真核生物核糖体rRNA构建测序文库，鉴定贵州百香果病毒种类，并利用RT-PCR验证，为建立贵州百香果病毒种类鉴定、分子检测和病害防控具有重要指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

2020年6月至2021年6月，在贵州省贞丰县、镇宁县、关岭县及罗甸县等百香果主要种植地采集具有病毒病典型症状的样品，将其混合成4份，样品信息参见表1。

表1 贵州百香果疑似病毒侵染的样品信息Table 1 Information of suspected virus-infected samples of passion fruit in Guizhou

1.2 方法

1.2.1 百香果总RNA提取 利用TRIzol试剂(Invitrogen)提取4份样品的总RNA，具体操作步骤参照试剂说明书。使用琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA的降解程度及是否有蛋白等污染，应用Nanodrop 2000微量分光光度计(Thermo Fisher)检测总RNA的浓度，合格的样品用于文库构建。

1.2.2 文库建立与高通量测序及质控 将1.2.1的4份样品的总RNA等量混合为1份样品，利用 Illumina Ribo-Zero(PlantLeaf)试剂盒(MRZPL1224)去除样品rRNA。通过RT-PCR合成第1条cDNA链，然后再合成第2条cDNA链，经过纯化、加接头和片段筛选等一系列步骤构建测序文库。利用DNA 1000 assay Kit(Agilent Technologies)进行文库质检，利用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System(Life Technologies)进行定量，根据Illumina Hiseq 2500的PE150模式进行深度测序。根据 Illumina标准建库测序流程进行测序，获得原始序列(reads)，经过生物信息学分析，去除带接头和低质量的reads，以及连续低质量值碱基数默认小于Q20的碱基数目。获得的reads，利用MEGAHIT对高质量reads进行组装，筛选最优组装结果，相关参数均使用默认值。

1.2.3 病毒RT-PCR验证 根据拼接获得的序列设计EAPV、TeMV 和PLV的CP基因特异性引物，引物序列见表2。利用反转录试剂盒(Thermo Scientific)反转录合成cDNA第1链。以4份样品总RNA模板的反转录产物作为扩增模板进行RT-PCR扩增，扩增体系20.0 μL：cDNA为2.0 μL、上下游引物各0.5 μL、Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)为10.0 μL、ddH2O为7.0 μL。RT-PCR反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35次循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，然后将目的片段进行回收纯化并送测序。

表2 病毒RT-PCR扩增引物信息Table 2 Information of RT-PCR amplification primes of viruses

1.2.4 病毒系统发育分析 PCR扩增产物测序后序列在NCBI数据库进行Blastn分析比对。基因开放阅读框(open reading frame,ORF)使用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov / orffinder /)预测。利用Clustal W程序进行多序列比对，使用MEGA 7.0采用Neighbor Joining法构建系统进化树，设置Bootstrap值为1 000次。为明确TeMV-GZ、EAPV-GZ、PLV-GZ1-4与已经报道的TeMV、EAPV和PLV分离物的系统进化关系，分别以大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus,SMV,FJ548849)、菜豆普通花叶病毒(Beancommonmosaicvirus,BCMV,AJ312437)和蓝莓焦斑病毒(Blueberryscorchvirus,BBScv,KP232982和AY941198)为外群，对3种病毒相关的CP核苷酸序列和氨基酸序列构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 宏转录组测序获得的病毒序列信息

对疑似感染病毒的百香果样叶进行宏转录组测序，利用Illumina Hiseq 2500进行双末端测序，每端碱基长度均为150 bp，得到大量的原始reads，共1 189 414条序列。经质控后共获得1 188 101条高质量序列，占99.89%。对所有注释为病毒相关的重叠群(Contig)进行统计表明，数据库中共有1 374 705条序列与病毒比对成功，占总量的1.74%。

2.2 病毒组装与注释

经组装比对，共有605条contig注释为病毒序列，总的contig长度为138 285 bp，平均长度为229 bp。发现3种已报道过侵染贵州百香果的病毒，分别为TeMV(NC009742)、EAPV(NC007728)和PLV(NC008292)。其中，数量最多的是PLV，共有275条，contig最大长度为685 bp；其次是EAPV，有166条，contig最大长度为3 912 bp；最后是TeMV，仅48条，contig最大长度为307 bp；其他种类的病毒共比对30条，contig最大长度为1 502 bp(表3、图1)。

表3 病毒相关contig分类Table 3 Classification of virus-related contig

图1 病毒相关contig长度分布Fig.1 Length distribution of virus-related contig

2.3 病毒相关reads数量分布

由图2可见，EAPV(NC007728)含有的166条contig，其含有875 099条reads，占总的病毒reads数量的63.65%；PLV(NC008292)含有的275条contig，其含有477 305条reads，占总的病毒reads数量的34.72%；TeMV(NC009742)含有的48条contig，其含有21 795条reads，占总的病毒reads数量的1.59%；此外，注释为其他种类病毒的reads数量有506条，占总量的0.04%。

图2 病毒相关reads的分类统计Fig.2 Classification statistics of virus-related reads

2.4 病毒的RT-PCR验证

由图3可见，4份样品均能扩增3种病毒，分别将扩增的PCR产物测序，获得的CP基因序列通过NCBI数据库进行Blastn比对发现，与已报道的TeMV、EAPV和PLV序列有较高的相似性。TeMV贵州分离物(TeMV-GZ)与已报道分离物的核苷酸序列一致性为87.6%～99.7%(MK340754)；EAPV贵州分离物(EAPV-GZ)与已报道分离物核苷酸序列一致性为85.2%～99.8%(MG650164)；PLV贵州分离物与已报道分离物核苷酸序列一致性为93.0%～95.4%(MT723990)；4个PLV贵州分离物多序列比对相似性较高，核苷酸序列一致性为99.5%～100%。将获得的PLV贵州分离物分别命名为PLV-GZ1、PLV-GZ2、PLV-GZ3和PLV-GZ4。

注：M为DL 2 000 plus marker，1～4为样品，5为阴性对照，6为空白对照。Note:M,DL 2 000 plus marker;1～4,samples;5,negative control;6,blank control.图3 百香果3种病毒的 RT-PCR检测Fig.3 RT-PCR detection of three viruses infecting passion fruit viruses

2.5 病毒系统发育树

如图4所示，获得的TeMV-GZ分离物与6个不同分离物(MT557572,KJ789129,MN389481,MN384679,MN384683,MN384682)聚为一支，并与其他6个分离物(MH623079,MH500106,MH500104,MH500103,MH500102,MH500101)组成第2大类群；TeMV-GZ分离物与12个不同分离物(MN384683,MH500103,MH500106,MN384682,MH500104,MH500102,MH623079,MT557572,KJ789129,MN384679,MH500101,MN389481)聚集于同一个大的分支，与MN384679亲缘关系较近。EAPV-GZ分离物与12个分离物(AB627437,AB690447,AB627436,AB690439,AB690444,AB690441,KP114136,AF208662,FR694184,MT450870,MN549400,MG650164)聚集于同一个大的分支；EAPV-GZ分离物与11个分离物(MG650164,MN549400,MT450870,KP114136,AB690441,FR694184,AF208662,AB690447,AB690444,AB627437,AB690439)聚集于1个大的分支，且与MG650164亲缘关系较近。

图4 基于外壳蛋白核苷酸序列(A)和氨基酸序列(B)构建的病毒贵州分离物与Carlavirus属其他病毒的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of the PLV Guizhou isolates based on coat protein nucleotide (A) and amino acid sequence (B) and other viruses of Carlavirus

目前，NCBI数据库中已报道的PLV病毒序列4对，与获得的PLV贵州分离物进行系统发育分析。4个PLV贵州分离物单独聚在一起，然后与德国百香果分离物PLV-DSMZ(MT723990)、西班牙百香果分离物PLV-Rehovot(MH379331)、韩国百香果分离物(OK274270)和以色列百香果分离物(NC008292)聚集在一起；4个PLV贵州分离物与(OK274270,NC008292,MT723990,MH379331)聚为一支。

3 讨论

目前，植物病毒检测技术主要有生物学检测、血清学检测、电子显微镜检测、分子生物学检测和高通量测序等方法[6，14]。与传统的分子生物学检测方法相比，小RNA测序技术组装的病毒基因序列相对较短，常用于检验已知病毒的基因组序列。本试验应用的去真核生物核糖体rRNA，测序为双末端，片段长度为150 bp。去除含量最丰富的核糖体rRNA，能够提高病毒基因组核酸含量，检测到更多的病毒RNA序列，从而提高检测灵敏度，主要用于检验未知病毒物[15-16]。

从4份疑似病毒侵染的百香果混合样品中检测到TeMV、EAPV和PLV共3种病毒，利用RT-PCR验证并测序，其中，TeMV和EAPV测序结果与已报道病毒核苷酸序列有较高的相似性。TeMV在泰国[17]、福建[11]、广西[8]和贵州[13]等百香果种植地均有发生；EAPV在福建[10]和广西[8]也相继被报道能侵染百香果。PLV是乙型线形病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)成员，对百香果侵染表现为不明显的系统性花叶症状，老叶呈现斑驳症状[18]。PLV最早报道在国外，开始于德国、随后在美国和澳大利亚的报道中发现并证实该病毒能够侵染百香果[18-20]，该病毒在国内尚未明确报道。SPIEGEL等[21]已经证实PLV病毒与卡拉病毒属的颗粒形态、宿主范围和血清学反应极近相似，具有卡拉病毒属的典型特征，并且与蓝莓焦斑病毒亲缘关系密切。目前对该病毒的传播机制尚未明确，有关方面的报道较少，可能是通过引种或其他方式传播到国内，也可能是协作侵染等因素有待进一步研究。至今贵州地区百香果上未有该病毒发生的明确报道，同时对百香果的产量是否有一定的影响尚未明确。

TeMV、EAPV贵州分离物与已报道分离物的核苷酸序列一致性分别为87.6%～99.7%、85.2%～99.8%。PLV贵州分离物CP基因核苷酸序列一致性为99.5%～100%，与已报道分离物核苷酸序列一致性为93.0%～95.4%。系统进化分析结果表明，PLV分离物单独形成1个分支，相同地区的分离物优先聚集在一起，表现出较强的地域性。因此，通过建立分子检测体系，可为后期病毒检测和防控提供理论依据，同时为保证种苗健康繁育，建议大力推广无病毒苗木，减少病毒传播，促进贵州百香果产业健康可持续发展。

4 结论

对贵州4个主产区疑似病毒侵染的百香果叶片进行病毒种类鉴定表明，EAPV、PLV和TeMV的含量分别占63.65%、34.72%和占1.59%，其他的病毒共占0.04%。通过RT-PCR法进一步证实4份样本中均含有TeMV、EAPV和PLV，侵染贵州百香果的病毒主要是TeMV、EAPV和PLV。