非洲猪瘟病毒B646L和F778R双基因PCR 检测方法的构建

王 慧，钟菊花，杨 俊，杜丽飞，王红兵，刘俊琦，2*

（1.湖南省畜牧兽医研究所，长沙 410128；2.湖南农业大学动物医学院，长沙 410128）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种急性、出血性、高传染性、高致死性的疾病，该病主要发生在家猪和野猪中，致死率高达100%［1-2］。ASFV 是非洲猪瘟病毒科非洲病毒属的唯一成员，也是目前唯一已知的双链DNA 虫媒病毒，其基因组大小约190 kb，可编码170 多种蛋白［1］。其中编码的大多数蛋白功能尚不明确，限制了ASFV 致病机理的研究以及疫苗的研制［3］。ASFV 基因组中的B646L基因主要编码衣壳蛋白p72。p72 蛋白不仅是ASFV 病毒粒子的主要组成成分，也是ASFV 检测中常用的靶标之一。基于B646L基因的3′端可变核苷酸序列进行分类，ASFV 在全世界至少有24种基因型［4-6］。

ASF 于1921 年首次在肯尼亚发现，起初只是非洲撒哈拉以南的一种地区性疾病，后来十年时间内便成为了严重威胁全世界猪业发展的一种猪传染性疾病，其中对欧洲和亚洲影响最大［7-8］。2018 年，中国首次发现ASFV［9］，随后蔓延开来，出现各种传播速度快且自然变异能力强的ASFV 毒株，给我国生猪养殖业造成了巨大的损失［10-12］。

ASFV 病毒粒子结构复杂，不同的毒株毒力、传播力不同，且不同毒株之间交叉保护力弱［13］，各猪场根据实际情况制定的监控、防护措施及定点清除的方法大不相同，毒株的早期发现和清除较为困难。ASF 的早期预防、发现、诊断以及毒株分型对于防控具有至关重要的作用［11］。国内尚无同时检测ASFVB646L和F778R基因的双基因PCR 检测方法，且同时检测多基因可增强该方法的特异性，因此，本研究以ASFVB646L基因和F778R基因为检测靶点，建立双基因普通PCR 检测方法，为检测ASFV提供一种快速、准确、灵敏的检测手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株和质粒

ASFV、猪圆环病毒2 型（porcine circovirus 2，PCV2）、伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）、猪流行性腹泻病毒（porcineepidemic diarrhea virus，PEDV）及猪传染性胃肠炎病毒（swine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）核酸由湖南省畜牧兽医研究所兽医兽药实验室保存。B646L质粒标准品和F778R质粒标准品由北京擎科生物科技股份有限公司提供，质粒质量浓度皆为200 ng/μL。拷贝数分别为7.2×1010copies/μL、1.5×1011copies/μL。拷贝数计算公式：拷贝数（copies/μL）=［质粒质量浓度/（ng/μL）×10-9］×（6.02×1023）÷（碱基数×660）。

1.1.2 主要试剂与仪器

病毒DNA/RNA 小量提取试剂盒购自湖南大圣宠生物科技有限公司；Pfu DNA 聚合酶购自杭州博奥尔科技有限公司；普通PCR 仪购自德国eppendorf生物科技有限公司；凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司；电泳仪，北京市六一仪器厂。

1.1.3 引物的设计与合成

根据GenBank 中已登录的B646L和F778L基因序列，在NCBI 上选择来源于20 条（各10 条）非洲猪瘟毒株的B646L和F778L基因全长序列，通过MegAlign 软件筛选基因的保守区域，并使用NCBI网站的Primer designing tool 各自设计两对特异性引物（表1）。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2 方法

1.2.1 PCR反应程序与反应体系的优化

1.2.1.1 普通PCR反应体系与反应程序

PCR 反应体系：Pfu 酶0.5 μL、10×Reaction Buffer 2.5 μL、2.5 mmol dNTP Mixture 2.0 μL、两对10 μmol/L 上下游引物（B646L上、下游引物，F778R上、下游引物）各1.0 μL、DNA 模板1.0 μL、ddH2O 15.0 μL。

PCR 反应程序：95℃预变性5 min，95℃变性15 s、退火温度为56℃、退火15 s、72℃延伸，30 个循环。

扩增完成后，使用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，使用凝胶成像系统观察条带的位置与明亮度。

1.2.1.2 反应体系的优化

对反应体系组分中dNTP 及反应程序中退火温度依次进行优化，得到最优引物比和组分比。设置dNTP 分别加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL；退火温度分别为55、56、57、58、59、60、61、62℃。通过优化筛选出最适合的反应体系和反应程序，建立普通PCR 检测方法，对获得的PCR 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 特异性试验

分别以PCV2、PRV、PEDV 及TGEV 核酸为模板，同时以ASFV两种阳性质粒标准品为阳性对照，以ddH2O 为阴性对照，按照1.2.1 优化的反应条件对本方法进行特异性检测，观察能否扩增出条带，以验证其特异性。

1.2.3 敏感性试验

通过十倍比稀释，以不同浓度的两种ASFV 阳性质粒标准品作为扩增模板，以本方法建立的双基因普通PCR 方法进行检测，确定本方法的最小可检测质量浓度。

1.2.4 重复性及临床验证试验

以最低检测限度的ASFV 阳性质粒标准品进行重复试验，对实验室保存的ASFV 阳性核酸样本进行临床验证应用，按优化后的PCR 反应体系及反应条件进行，根据得到的结果进行分析，以验证该方法的重复性。

2 结果与分析

2.1 反应体系的优化

以ASFV 两种B646L和F778R质粒标准品为模板，利用两对引物进行PCR 扩增和核酸电泳，结果扩增出两条分别为约1 272 bp 和672 bp 的特异性条带，与预期结果一致（图1、2）。

图1 ASFV多重PCR检测方法引物的验证Fig.1 Verification of primers for ASFV multiplex PCR detection method

图2 ASFV多重PCR检测方法引物的验证Fig.2 Verification of primers for ASFV multiplex PCR detection method

经过反应体系优化，最终确认反应体系为：Pfu 酶0.2 μL、10×Reaction Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.5 μL、B646L上游和下游引物各1.5 μL、F778R上游和下游引物各0.5 μL、DNA 模板1.0 μL、ddH2O14.8 μL（图3、4）。

图3 ASFV多重PCR检测方法dNTP的优化Fig.3 Optimization of dNTP for ASFV multiplex PCR detection

图4 ASFV多重PCR检测方法引物比例的优化Fig.4 Optimization of primer ratio for ASFV multiplex PCR detection method

PCR 反应程序：95℃预变性1.5 min，95℃变性30 s、退火温度为57℃、退火30 s、72℃延伸2.5 min，30 个循环。2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，使用凝胶成像系统观察条带（图5）。

图5 ASFV多重PCR检测方法退火温度的优化Fig.5 Optimization of annealing temperature for ASFV multiplex PCR detection method

2.2 特异性试验

利用已建立的双PCR 方法，以PCV2、PRV、PEDV、TGEV 核酸为模板进行检测，结果发现，该方法对ASFV 质粒标准品进行了特异性扩增，无其他病原核酸扩增的情况，显示建立的方法具有较强的特异性。

2.3 敏感性试验

将B646L、F778R阳性质粒进行10 倍倍比稀释后作为扩增模板，以建立的双重普通PCR 方法和单一普通PCR 方法进行检测。结果显示，该方法对B646L及F778R两种ASFV 阳性质粒标准品的最低检测限分别为7.2×107copies/μL、1.5×106copies/μL（图6）。

图6 ASFV多重PCR检测方法敏感性检测限度Fig.6 Sensitivity limits of ASFV multiplex PCR assay

2.4 重复性试验

以最低检测限度的ASFV 阳性质粒标准品及实验室保存的ASFV 阳性核酸样本进行重复试验，结果显示，该方法重复性良好（图7）。

图7 重复性及临床验证应用Fig.7 Reproducibility and clinically validated application

3 讨论

多重PCR 是在普通单一PCR 反应体系基础上，即在1次PCR反应体系中加入2对或2对以上引物，以做到1 次扩增检测同一病原多种基因或多种病原。多重PCR 和单一PCR 的原理相同，但多重PCR的反应体系需要多次反复进行试验摸索，同时多对引物之间不可避免会出现竞争和互相干扰，且多对引物的退火温度不同，对多重PCR 反应体系的特异性和敏感性影响较大。这就要求引物要高度特异，退火温度尽量相近，才能够保证扩增到最大程度。

多重PCR 技术是将多个基因或序列在同一反应系统中同时检测，检测敏感性和特异性高，减少了假阴性和假阳性结果的发生，且缩短了试验的操作时间，增加了试验的效率，节省了反应试剂、样品和实验室时间的成本。

非洲猪瘟病毒基因组中主要编码衣壳蛋白p72的是B646L基因。p72 蛋白是ASFV 病毒粒子的主要组成成分，同时也常常用来作为ASFV 检测中的靶标之一。任名等［14］和吴亚楠等［15］均建立了基于B646L基因的TaqMan 荧光定量PCR 检测方法。苏金辉等［11］建立了基于针对B646L、F778R和I177L基因的三重荧光定量PCR 鉴别检测方法。本研究针对的B646L和F778R两个基因的序列均保守，与Georgia 2008/1株、AQS-P-201202 DNA株、SY-2株等相关基因序列的相似度达100%，具有良好的通用性。在此基础上，本研究针对B646L、F778R两个基因重新设计引物，确立了非洲猪瘟B646L、F778R双基因普通PCR的检测方法。

从试验结果看，本试验建立的该种普通PCR方法特异性、重复性较好，所建立的方法对ASFV阳性质粒B646L、F778R标准品的最低限度分别为7.2×107copies/μL、1.5×106copies/μL。相比于于新友等［16］建立的非洲猪瘟双重荧光PCR检测方法最低检测限度（9.5 copies/μL）及蔡晓丽等［17］非洲猪瘟病毒p72 和CD2v 双基因实时荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用的最低检测限度（7.3 copies/μL～24.5 copies/μL），以及苏金辉等［11］建立的基于针对B646L、F778R和I177L基因的三重荧光定量PCR 鉴别检测方法里B646L和F778R阳性质粒的最低检测下限（分别为1、10 copies/ μL）来说，本试验建立的普通PCR 方法的敏感性要差一些。这说明普通PCR 的敏感性还是不及荧光定量PCR的敏感性好。

在试验过程中，试验操作技术、样品或试验材料制备、基因变异等因素可能会造成病毒交叉反应、PCR 仪器污染或试剂污染，导致检测结果可能出现假阳性或假阴性。如要避免假阳性的发生，就需要加强实验室实验人员技术操作的规范性以及对实验室器材样品等的质量控制。检测环境中易产生气溶胶污染，也经常可能出现假阳性的情况。气溶胶等样品中DNA 含量极低，属于无法进行DNA 测定的低剂量环境污染样本，容易产生假阳性结果［18］。样本采集或处理不当也会导致样本中可能存在干扰物质或被污染，导致PCR 产生错误的结果。也可能是检测条件设置不当，导致PCR 结果偏高，产生假阳性；或者是PCR 试剂质量问题，如PCR 试剂可能受到氧化、污染或保存不当等因素的影响，导致PCR反应失调，也有出现假阴性的情况。其他可能出现假阴性的情况如下：1）ASFV 血清学类型不符。由于PCR 检测是基于ASFV 特定基因的DNA 序列扩增，所以如果ASFV血清学类型与PCR引物不相符，就会导致假阴性。2）样品处理不当。样品提取和制备过程中，如果操作不规范或出现污染等问题，就会影响PCR 检测结果。3）ASFV 数量过少。ASFV的含量过低也会导致PCR检测结果为假阴性。这通常是由于感染的早期或治疗后ASFV 数量低于检测限度所致。4）非洲猪瘟样品的反复冻融、保存不当会导致样品降解失效。5）核酸免抽提会导致核酸从蛋白质及盐等物质中没有完全的分离出来，不可避免地会使检测结果有所偏差，甚至出现假阴性［19］。

试验结果出现假阳性有以下四种解决办法：1）注意样本采集。确保样本的纯度和完整性，避免干扰物质的影响。2）对PCR 反应条件进行优化。使用恰当的引物，调整合适的温度，适当改变PCR反应条件，确保PCR反应的准确性。3）检查PCR试剂质量。检查PCR 试剂是否存在问题，如有问题及时更换。4）建立质控体系。建立ASF PCR 检测的质控体系，定期检查PCR 反应的准确性和稳定性。试验结果出现假阴性有以下三种解决办法：1）选择正确的PCR 引物。根据ASFV 的流行病学特点和病原体基因序列特征，合理选择PCR 引物，以提高检测敏感性和特异性。2）优化样品处理步骤。严格按照操作规程，避免样品污染，并对样品进行充分制备和提取，以确保检测结果准确。3）增加样品量或改变PCR 反应条件。如果ASFV 数量较少，可以增加样品量或改变PCR 反应条件，例如，增加反应时间、温度、循环次数等，以提高检测效率。总之，为了准确诊断ASF，必须采用合适的方法、设置正确的反应条件、注意质控和确保样本纯度等措施。