噬菌体在防控鱼类细菌性病害中的作用机制及其应用

周方方，胡胜标，张友明，夏立秋

（淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，微生物分子生物学湖南省重点实验室，湖南师范大学生命科学学院，长沙 410081）

水产品可为人体提供丰富的营养物质，如优质蛋白质、脂肪酸、维生素等［1］，能带来显著的营养成效，在人类饮食中不可或缺。联合国粮食与农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）的数据显示，水产品是世界上贸易量最大的食品种类之一，水产养殖产量占供人类消费的水生动物食品产量的56%［2］，其中，鱼类养殖是水产养殖的重要组成部分，提高鱼类养殖产量及水产品质量对人类健康饮食具有重要意义。

随着鱼类养殖规模的不断扩大及养殖模式的集约化，养殖密度的增大为条件性致病菌提供了有利的生存和繁殖条件，进而导致鱼类细菌性疾病的暴发。引起鱼类细菌性病害的病原菌主要有气单胞菌（Aeromonas）、假单胞菌（Pseudomonas）、爱德华氏菌（Edwardsiella）、弧菌（Vibrio）等革兰阴性菌，以及链球菌（Streptococcus）、乳球菌（Lactococus）等革兰阳性菌［3］。常见的鱼类细菌性疾病主要包括由嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）及温和气单胞菌（Aeromonas sobria）等病原菌引起的败血症［4］、由柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）等病原菌引起的细菌性烂鳃［5］和由肠型点状气单胞菌（Aeromonas punctta）等病原菌引起的细菌性肠炎［6］。抗生素作为水产养殖中防治细菌性病害的重要手段，主要通过饲料摄入等方式进入养殖生物体内发挥作用。但有研究表明，30%～90%的抗生素未被生物体吸收，而是残留在水产环境中或通过生物废物排放到养殖环境中［7］，使得抗生素和耐药基因在水体、沉积物中积累，这导致水产环境中耐药菌的大量繁殖以及耐药基因在微生物群落中的转移［8-9］。Chen 等［10］在我国东南部13 个主要海水养殖场的水体和沉积物中发现了11 种抗生素化合物以及9 种耐药基因。嗜水气单胞菌是鱼类细菌性病害的主要致病菌。Peng 等［11］在我国四川多个地区分离到64 株嗜水气单胞菌，分离株对红霉素、复方新诺明、磺胺呋唑、阿莫西林等常见抗生素的耐药率高达60%～98%，其中15 株具有多耐药性，并从分离株中鉴定出63 个耐药基因。抗生素的滥用使得养殖场沉积物成为水生生物的耐药基因库，若养殖场的水体未经有效处理通过地球水循环流入海洋、地表水等，将会对人类的生活质量造成恶劣的影响［9］。

抗生素在鱼类细菌性病害的防治中发挥了重要作用，但抗生素的滥用会带来病原菌耐药性增强增加防治难度、药物残留积累在水产品中危害人类健康、污染水体和破坏生态平衡等一系列问题［12-13］。因此，鱼类养殖产业亟待寻求新方法，在保护生态环境的同时防治鱼类细菌性病害，以提高鱼类养殖产量和产品质量。噬菌体（Phage）作为一种天然、无残留的细菌杀手，具有特异性强、裂解效率高等特点，因此，利用噬菌体防治鱼类细菌性病害是一种重要的对环境友好的绿色防控技术，对鱼类健康养殖和加快发展水产养殖业具有重要意义。

1 噬菌体及其作用机制

1.1 噬菌体裂解宿主细菌的类型

噬菌体是一种能够特异性侵染、裂解细菌的病毒，广泛地存在于自然界中，甚至在南极土壤、沙漠等极端环境中也有分布［14］。噬菌体主要由核酸和蛋白质构成，根据噬菌体的生长周期可将其分为烈性噬菌体和温和噬菌体。烈性噬菌体的繁殖包括特异性吸附、侵入、核酸复制及蛋白质合成、噬菌体装配、子代病毒释放5 个阶段。当子代噬菌体在宿主菌中装配完成达到一定量时会裂解宿主细菌，同时，释放的子代噬菌体可以继续感染邻近的宿主细菌，从而杀死细菌并抑制细菌的繁殖。温和噬菌体侵入宿主细菌后，一般以其核酸插入到宿主的基因组中［15］，并随宿主基因一起复制，此时的噬菌体称为前噬菌体，并不会引发宿主细菌的裂解，但当受到外部压力刺激时，如紫外线和丝裂霉素［16］等，前噬菌体脱离基因组被诱导进入裂解周期。目前，利用噬菌体治疗防控鱼类细菌性病害更倾向使用烈性噬菌体，主要是为了避免温和噬菌体基因组携带抗生素耐药基因或毒力基因整合到细菌基因组中，从而导致宿主细菌的毒力增强［17］。

1.2 噬菌体的裂解机制

噬菌体的裂解系统主要有两种，“穿孔素（holin）-内溶素（endolysin）”裂解系统和“针穿孔素（pinholin）-SAR内溶素”裂解系统，如图1所示。噬菌体裂解宿主菌主要依赖于其侵染宿主菌后在宿主菌中表达的裂解蛋白，主要包括穿孔素、内溶素，一些革兰阴性菌还需要穿膜蛋白（spanin）［18-19］。

图1 噬菌体裂解系统的主要特征［29］Fig.1 Key feature of phage lysis system［29］

穿孔素是一类能够在细菌内膜上形成“孔”的较小的跨膜蛋白［20］，根据其跨膜结构域（transmembrane domain，TMD）数量可分为3 类［21］：Ⅰ类含有3 个TMD，如λ 噬菌体的穿孔素；Ⅱ类含有2 个TMD，如P21 噬菌体的穿孔素；Ⅲ类含有1 个TMD，如T4 噬菌体的穿孔素。穿孔素在宿主菌内表达后会在内膜聚集，达到一定浓度后会在内膜上形成跨膜的管状通道，使得内溶素通过管状通道作用于外部的肽聚糖［22］。针穿孔素属于穿孔素，在内膜上形成的通道更小、似针孔，可使内膜质子动势上升，激活SAR内溶素［23］。

内溶素又称裂解酶，是噬菌体在宿主菌中表达的一类细胞壁水解酶，主要有葡糖苷酶、酰胺酶、肽链内切酶和转糖基酶。在噬菌体裂解后期，内溶素通过穿孔素形成的通道作用于肽聚糖，最后裂解细菌［24］。革兰阳性菌的内溶素N 端通常含有酶活性结构域（enzymatically active domains，EAD）、C 端通常含有细胞壁结合结构域（cell walls binding domains，CBD），革兰阴性菌内溶素通常只有一个EAD而不含CBD［25］。SAR 内溶素是一种胞壁酸酶，其N端含有一个介导酶的跨膜分泌的SAR 序列，可介导SAR 内溶素分泌至细胞周质，此时的SAR 内溶素无活性［26］。

穿膜蛋白能够破坏革兰阴性菌的外膜，由一个小的外膜脂蛋白和一个完整的细胞质膜蛋白组成，分别被称为o-spanin 和i-spanin，跨膜蛋白破坏外膜的可能机制是催化内外膜的融合［27-28］。

1.3 噬菌体治疗

早在20 世纪初期，噬菌体被Twort 发现能够裂解细菌，D’Herelle 尝试将噬菌体应用于临床治疗，并将噬菌体成功地用于治疗4 例儿童细菌性痢疾［30］。但由于当时技术方法和基础认知的限制，噬菌体治疗并没有被广泛地接受和应用，直到青霉素的发现。20 世纪40 年代，抗生素被广泛地应用于治疗细菌性感染，并取得显著成效，人们更是忽略了噬菌体治疗［31］。抗生素在鱼类养殖业中的大量使用导致鱼类致病菌耐药性增强、药物残留积累，这给人类的健康饮食带来了巨大的隐患。2022 年，世界卫生组织首次全面评估了抗生素耐药性给全球人类健康带来的影响，耐药性对发病率、死亡率和致残率的影响至少与人类免疫缺陷病毒和疟疾一样大。因此，发现、设计和开发新的替代性抗菌疗法并将其应用于鱼类养殖至关重要，而最有希望的途径之一是噬菌体疗法［32］。

噬菌体治疗主要包括单个噬菌体治疗［33］、噬菌体鸡尾酒治疗［34］、噬菌体-抗生素协同治疗［35］、噬菌体衍生的裂解酶治疗［36］4 种手段。噬菌体治疗在多个邻域得到了实际应用，噬菌体有希望成为抗生素替代抗菌剂，特别是对于一些由耐药性细菌引起的细菌性疾病。噬菌体对侵染的宿主细菌具有专一性，即只能侵染某一种或亲缘关系较近的几种细菌，具有一定的安全性。将噬菌体应用于鱼类养殖防治鱼类细菌性病害是一种对环境友好的绿色防治手段，这对提高水产品质量、保护养殖环境具有重要意义。

2 噬菌体治疗在鱼类细菌性病害中的研究现状

2.1 鱼类病原菌噬菌体的分离纯化

现有鱼类病原菌噬菌体的分离方法大同小异。以鱼类病原菌作为指示菌，将其与取自鱼塘［37］、养殖场污水排出口［38］、水产市场［39］、鱼体肠道［40］等处的水样用培养基共培养过夜后离心，上清液用0.22 μm 滤头过滤除去菌体，将滤液滴在涂有指示菌的平板上，若出现透明的裂解区，则刮取其上的菌斑到含有相应指示菌的液体培养基中扩大培养；最后，通过双层平板法分离、纯化单个噬菌体，直至双层板上的噬菌斑大小相近［41］。

2.2 应用

相比抗生素，噬菌体具有对宿主细菌特异性侵染、繁殖快、不易产生耐药性等优点，在大型养殖业中用于防治细菌性病害具有显著优势。1981 年，Wu 等［42］分离到了嗜水气单胞菌噬菌体AH1，并通过注射噬菌体到感染了嗜水气单胞菌的泥鳅［Misgurnus anguillicaudatus（Gantor）］体内，结果表明，其具有较好的治疗效果。现有研究表明，噬菌体用于防治鱼类细菌性病害主要通过注射、侵浴、饲喂等给药方式（表1）。

表1 噬菌体不同给药方式在鱼类细菌性病害防治中的应用Tab.1 Application of different phage administration methods in the prevention and treatment of bacterial diseases in fish

综上所述，噬菌体对于鱼类细菌性病害具有一定的防治效果，但噬菌体不同的给药途径、给药浓度等因素会导致防治效果有一定的差异。因此，结合养殖条件、防治成本等实践因素，研究噬菌体的最佳给药途径、给药浓度对于噬菌体在鱼类养殖中防治细菌性病害具有重要意义。在2021 年，崔惠敬［54］通过饲喂、注射和浸浴等给药方式，研究了3 株噬菌体对由迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）引起的大菱鲆腹水症的防治效果，发现腹腔注射和浸浴噬菌体的最佳时间是感染当天，MOI=100，大菱鲆的存活率分别为67%和60%；饲喂噬菌体对大菱鲆具有较好的保护效果，且相比于腹腔注射和浸浴，饲喂噬菌体能让噬菌体在动物肠道存留时间更长。Kunttu等［55］通过浸浴和口服的给药方式探究了3 种噬菌体FCOV-S1、FCOV-F2 和FCL-2 对感染柱状黄杆菌虹鳟鱼鱼苗的预防和治疗效果，发现在细菌感染之前和疾病症状出现时进行浸浴治疗是预防虹鳟鱼柱状黄杆菌感染的最有效方法。

在鱼类养殖中大范围地应用噬菌体还需要考虑养殖环境对噬菌体治疗效果的影响、噬菌体在鱼体内的安全性、合理的给药方式等因素。Silva等［56］通过研究表明，噬菌体的治疗效果主要受盐度和有机质含量的影响，即噬菌体治疗的有效性在一定范围内随着水盐含量的增加而增加。因此，在鱼类养殖中，可以在不影响鱼类生长的条件下通过添加盐来提高噬菌体治疗的成功率。Chamilani 等［57］通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）检测了浸浴于迟缓爱德华氏菌噬菌体ETP-1的斑马鱼中IL-β、TNF-α、IL-6、和IL-10 等相关炎症因子mRNA 的表达量，发现其与未浸浴噬菌体的对照组相似。Christiansen 等［58］和Madsen 等［59］量化了虹鳟鱼鱼苗经腹腔注射后嗜冷黄杆菌（Flavobacterium psychrophilum）噬菌体和宿主细菌在鱼体内的扩散。在注射后的第10 天仍然能从鱼的器官中分离出噬菌体和细菌，与只注射噬菌体相比，细菌和噬菌体同时注射能使噬菌体在鱼的器官中停留时间更长。噬菌体和细菌在肾脏和脾脏的发生率最高，在脑部的发生率较低。试验表明，注射的噬菌体在没有细菌的情况下也能在鱼的内脏中迅速扩散。由此可见，噬菌体在鱼体内应用具有一定的安全性。

水产养殖在实际应用噬菌体的过程中，为了确保噬菌体防治鱼类细菌性病害效果的最大化，在进行噬菌体治疗之前，要针对不同的养殖鱼和相应的病原菌及其噬菌体，研究出噬菌体的最佳给药浓度、给药方式以及噬菌体在鱼体内的安全性等条件。

3 总结与展望

水产品在人类饮食中占有重要地位，鱼类养殖是水产养殖的重要组成部分，而细菌性病害是影响鱼类养殖产量、质量的重要威胁之一。抗生素作为鱼类养殖中防治细菌性病害的主要手段，不合理的使用会造成耐药菌的大量繁殖，从而大大增加防治难度。噬菌体是重要的抗生素潜在替代剂，相比于抗生素等有残留化学药物，噬菌体在宿主细菌的存在下能够自我复制进行繁殖，在大自然中大量存在，对宿主细菌具有特异性，这些优势使得噬菌体治疗在这个抗生素滥用的时代逐渐被重视。噬菌体治疗作为一种对环境友好的绿色防治技术在鱼类养殖细菌性病害的防治中具有重要意义。

噬菌体广泛地存在于自然界中。取水样或土样，与相应病原菌共培养富集、双层平板法检测和纯化可得到单个噬菌体。噬菌体侵染宿主细菌后，利用宿主物质和能量表达穿孔素和内溶素。穿孔素在细胞膜聚集达到一定浓度后形成管状通道，内溶素通过该通道作用于肽聚糖，一些革兰阴性菌还需要穿膜蛋白作用于外膜，最后裂解宿主细菌，释放的子代噬菌体还可以继续侵染周围的宿主细菌。在鱼类养殖中实际应用噬菌体防治常见的鱼类致病菌时，研究人员参考噬菌体的最佳MOI 探究给药浓度，常使用的给药方式有注射、浸浴和饲喂（口服），通过qRT-PCR检测噬菌体进入鱼体后相关炎症因子的表达量、鱼内脏组织病理切片苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察［44］等方法探究噬菌体在鱼体内应用的安全性。

随着噬菌体对宿主细菌侵染时间的延长，宿主细菌会逐渐对噬菌体产生抗性，抗性菌的生存繁殖给噬菌体带来一定的阻碍。因此，研究人员基于单个噬菌体治疗研究出了噬菌体鸡尾酒、噬菌体裂解酶、工程噬菌体等技术，弥补了这一不足。

噬菌体鸡尾酒即将某一种或一类病原菌的2 种或多种噬菌体混合，用于治疗相应细菌性病害，并且在一定程度上可以延缓抗性菌的产生和繁殖［60-61］。Se 等［52］发现，使用2 种噬菌体对感染香鱼假单胞菌大黄鱼的治疗效果优于只使用1 种噬菌体的治疗效果。

革兰阳性菌细胞壁缺乏外膜，内溶素可以从外部作用接触肽聚糖裂解细菌［62］。革兰阴性菌细胞壁外侧的外膜阻碍了内溶素直接从外部作用肽聚糖，降低抑菌效果［63］。对内溶素进行改造可以提高内溶素的活性、扩宽裂菌谱、提高溶解度等［64］。Son 等［65］将蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）噬菌体内溶素LysB4 与金黄色葡萄球（Staphylococcus aureus）菌噬菌体内溶素LysSA11 融合在一起，既可以裂解蜡样芽孢杆菌，又可以裂解金黄色葡萄球菌。研究人员通过添加乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、有机弱酸等可以增强内溶素穿透革兰阴性菌外膜的能力。Jiang 等［66］将沙门氏菌（Salmonella）噬菌体SLMP1的内溶素与5 mmol/L EDTA 搭配使用，发现其能够裂解多种革兰阴性菌和革兰阳性菌。相较于抗生素，噬菌体裂解酶具有不易使细菌产生耐药性、在环境中易降解、裂解范围较广等优点，在鱼类养殖中对于防治细菌性病害具有很大的潜力，但体内应用噬菌体裂解酶还需要考虑裂解酶的安全性、包埋方法等因素［67-68］。

噬菌体治疗在防治鱼类细菌性病害的应用中，主要是通过注射、浸浴或饲喂（口服）一种噬菌体或噬菌体鸡尾酒。随着基因组测序技术、生物信息学、多组学的发展，研究人员对噬菌体结构、裂解机制有了进一步了解，噬菌体裂解酶［35,69］、工程噬菌体［70-72］等也逐渐被研究并应用于实践中。噬菌体裂解酶相较于噬菌体裂解细菌的范围更广，是一种潜在的抗菌剂。对于革兰阴性菌的外膜，还可以通过在噬菌体裂解酶的N 端添加穿膜肽（membrane-permeable peptide）［73-74］、抗菌肽（antibacterial peptide）［75-76］等多肽以协助裂解酶穿过外膜，增强其抗菌效果。在噬菌体基因组上通过基因编辑使其上携带编码抗菌物质的基因，当噬菌体侵入宿主病原菌中时，可在宿主细菌中编码一些抗菌物质，如酸溶性孢子蛋白（small acid-soluble spore protein，SASP）［70］、细菌素（bacteriocin）［71］等，增强噬菌体的裂解效果并延缓噬菌体抗性的产生。噬菌体裂解酶和工程噬菌体实际应用于防治鱼类细菌性病害的相关研究报道不多，但具有一定的潜力。相信未来噬菌体治疗在防控鱼类细菌性病害的应用会给鱼类养殖产业带来光明的前景。