不同产地兔眼蓝莓花青素含量分析

粱光丽，和玉凤，李南，吕燕，和春龙，穆洪瑞

（1.云南商测质量检验技术服务有限责任公司，云南 昆明 650217；2.昆明市粮油饲料产品质量检验中心，云南 昆明 650106；3.云南联大科技产业有限责任公司，云南 昆明 650500）

蓝莓（Vaccinium Spp.），又名蓝浆果、越橘、都柿、笃斯等，为杜鹃花科越橘属多年生常绿或落叶灌木[1]，原产于加拿大东部和美国东北部，现在中国的山东半岛、大兴安岭、小兴安岭、四川盆地、滇西、湖北等地区均有种植[2]。蓝莓果实为浆果，富含氨基酸类[3]、有机酸类[4]、糖类[5]、黄酮类[6]、多酚类[7]、矿物质类[8]等营养成分。

蓝莓中的花青素是一类天然的水溶性色素，具有抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗炎、抑菌、预防肥胖、保护心血管、降血糖、改善视力、提高认知能力、预防老年痴呆、预防癌症、调节肠道菌群等活性作用[9-11]，所以蓝莓广泛应用在食品、医药、保健品、化妆品等领域。文章以云南省不同地区的蓝莓为研究对象，在探讨不同区域蓝莓中花青素含量差异的同时，也可以为今后蓝莓的种植和深加工提供数据支持[12]。

1 材料与方法

1.1 供试材料

产地及来源见表1。新鲜兔眼蓝莓，乙腈、无水乙醇、甲醇、甲酸均为色谱纯，盐酸（HCl）：优级纯；标准品：飞燕草色素（纯度≥95.0%）、矢车菊色素（纯度≥98.0%）、芍药色素（纯度≥97.6%）购自国药集团化学试剂有限公司。Waters ACQUITY超高效液相色谱仪（PDA检测器，Version 41Empour工作站），美国Waters公司；UPT-II-5/10/20T超纯水机，西安优普；OSB-2200 220V油浴锅，上海爱朗仪器有限公司；DK3000D数码超声波清洗机，深圳市德康洗净电器有限公司；电子天平，万分之一，BSM-220.4（220 g；0.0001g），上海卓精电子科技有限公司。

表1 兔眼蓝莓产地来源

1.2 试验方法

采用四分法分取样品，取约100 g于匀浆机中匀浆，在-18℃条件下保存，备用。称取样品5 g置于50 mL具塞比色管中，加入提取液至刻度，定容，摇匀，常温下超声提取40 min，取出，油浴锅（100℃）中水解90 min，取出后冷却至常温，用提取液定容至25 mL，摇匀，静置30 min，取上清液，用0.22 μm微孔水相滤膜过滤，装瓶上机测定。样品制备好后，在4℃条件下，保存时间不超过3 d。

1.3 条件的优化

1.3.1 仪器条件的选择

色谱柱：C18/PFP柱100 mm×2.1 mm×2.7 μm；流动相A为20 mmol乙酸铵溶液，流动相B为乙腈溶液，洗脱梯度为0～0.83 min，95%A，5%B；0.83～1.95 min，65%A，35%B；1.95～2.81 min，100%B；2.81～5.84 min，95%A，5%B；检测波长：254 nm；柱温：35℃；进样量：2 μL；流速：0.3 mL·min-1。

1.3.2 提取温度和时间

将油浴温度设为固定值95℃，从40 min到120 min每间隔10 min（9个时间段）对比测定花青素含量，同理将油浴时间固定在90 min，80~120℃每间隔10℃增加油浴温度，通过对比花青素含量的变化选择最优的提取温度和时间。

1.3.3 提取液的选择及花青素含量测定

在提取液选择方面，固定油浴温度100℃和油浴时间90 min，以40%、50%、60%、70%、80%的酸性乙醇溶液为提取剂测定的花青素含量。

2 结果与分析

2.1 方法优化结果

相较于传统的液相色谱法，采用UPLC法，飞燕草色素、矢车菊色素和芍药色素3种色素均能在3 min内全部出峰，尽管分离效果未完全达到基线，但对比相关同类UPLC法，出峰时间是同类方法的1/2，大大缩短了花青素的分析时间，大幅度提高了花青素分析工作的工作效率。

固定最佳提取时间90 min，随油浴温度的升高，80～90℃花青素提取效率显著升高，90～110℃趋于平缓，110～120℃逐渐降低，发现提取效率逐渐升高而后降低，过高的温度（大于110℃）对花青素提取不利。固定100℃，随着提取时间的增加，提取效率则呈抛物线趋势变化。所以在蓝莓花青素提取的前处理水解步骤上，选择用100℃油浴90 min作为最终的油浴条件。

针对上述不同比例提取液，提取效率则是呈先上升后下降的趋势，乙醇浓度在50%的时候提取效率最佳，即无水乙醇∶水∶盐酸=2∶1∶1（体积比），即取无水乙醇200 mL、水100 mL和盐酸100 mL。

2.2 线性方程的建立

分别准确称取飞燕草色素（Delphinidin）、矢车菊色素（Cyanidin）、芍药色素（Peonidin）标准品5.0 mg用10%盐酸甲醇溶液溶解并分别定容至10 mL容量瓶中，得到500 mg·L-1的单标储备液，将单一标准储备液进行混合后，用10%盐酸甲醇溶液作为溶剂，并分别配成1.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1、100.0 mg·L-1、200.0 mg·L-1的花青素混合标准使用液，对7个质量浓度水平的系列混合标准溶液进行测定，以各组分的峰面积（y）为纵坐标，对应的质量浓度（x，mg·L-1）为横坐标绘制标准曲线。从表2可见，6种花青素标液在一定质量浓度范围内具有良好的线性关系，线性范围广，相关系数（r）为0.9992～0.9998。

表2 花青素标液的线性方程及相关系数

2.3 色素含量分析

从图1可以看出，在兔眼蓝莓中花青素含量较为丰富，按色素类型分析呈现规律是飞燕草色素＞矢车菊色素＞芍药色素，其中飞燕草色素含量在1141～1893 mg·kg-1；矢车菊色素含量在203～529 mg·kg-1，芍药色素含量在117～376 mg·kg-1，飞燕草色素含量是矢车菊色素含量的3.5～5.7倍；飞燕草色素含量是芍药色素含量的3.7～10.0倍。

图1 云南5个地区兔眼蓝莓花青素含量

按地区类别分析，花青素总含量为丽江＞官渡＞玉溪＞楚雄＞红河、矢车菊色素含量为丽江＞官渡＞玉溪＞楚雄＞红河；飞燕草色素含量为丽江＞官渡＞玉溪＞红河＞楚雄；芍药色素含量为官渡＞玉溪＞楚雄＞丽江＞红河。

3 结论

不同产地兔眼蓝莓花青素含量存在较大的差异，可能是受不同气候和水地文条件影响。云南地处低纬度的云贵高原地区，由于地势北高南低，大大地加剧了因纬度而造成的气候差异。丽江取样点处于云南省的滇西北高原，属寒带型气候，境内水利资源丰富，动植物种类繁多，昆明、楚雄和玉溪取样点处于滇中高原，属温带型气候，四季如春，遇雨成冬；红河取样点处于滇南地区，属亚热带季风气候区，长夏无冬，一雨成秋。温差与花青素含量可成正比关系，建议在蓝莓种植的选址上可依据温差的大小进行甄选。