WNT6基因对蛋鸡卵泡颗粒细胞的影响及机制研究

祝启钊,谢晓磊,杨海霞,王晋,片慧芳,虞德兵

(南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095)

家禽卵巢卵泡按发育阶段可大致分为等级前卵泡(prehierarchical follicle,PHF)和排卵前卵泡(preovulatory follicle,POF)[1],二者间形态和功能上有巨大差异。等级前卵泡生长缓慢且容易发生闭锁,只有被选择成为排卵前卵泡之后,才可以免受闭锁并继续发育至成熟。其颗粒细胞也开始分化,类固醇激素的合成逐渐增加[2]。由等级前卵泡发育为排卵前卵泡这一过程被称为卵泡选择,此过程约每天一次[3]。蛋鸡卵泡的选择由复杂的正向和负向选择共同决定[4-5],使卵泡发育过程严格保持规律[6]。卵泡的选择与卵泡刺激素(FSH)和卵泡刺激素受体(FSHR)的功能密切相关[7]。FSHR基因在卵巢(颗粒、卵泡膜和基质)组织中有选择性表达[8-9],并且在6～8 mm卵泡中表达量最高[10]。这些证据都表明蛋鸡卵泡的颗粒细胞在卵泡选择的过程中起决定作用。

WNT(Wingless-type MMTV integration site family)配体蛋白属于分泌型糖蛋白家族,WNT配体通过与附近细胞表面膜受体结合激活WNT通路,进而通过β-catenin结合转录调控因子并介导下游靶基因的转录[11],其下游靶基因CCND1、C-myc、BIRC5等[12]与细胞增殖、凋亡的功能密切相关。

WNT4通过影响鸡颗粒细胞增殖与类固醇合成参与卵泡选择的调控[3],但本课题组未发表的转录组数据显示,等级前卵泡与排卵前卵泡颗粒细胞内WNT4基因表达水平并无显著差异,但是等级前卵泡颗粒细胞内WNT6基因表达水平显著高于排卵前卵泡颗粒细胞,提示WNT6可能参与蛋鸡卵泡选择。本研究检测蛋鸡各组织WNT6基因表达,并检测了WNT6对颗粒细胞增殖、类固醇合成以及卵泡选择关键基因的影响,以探究WNT6在蛋鸡卵泡选择过程中的生物学功能与调控机制,并完善蛋鸡卵泡选择调控网络。

1 材料与方法

1.1 试验动物处理与样本采集

本试验所用300日龄海兰褐蛋鸡购自南京盘滁机械化养鸡场,在采样前3 d均连续正常产蛋,颈部放血法屠宰5只,采集卵泡、胸肌、腿肌、肝脏、心脏、卵巢、肠道、肾脏等组织样本,装入冻存管内放入液氮速冻,随后放入-80 ℃冰箱保存,用于RNA提取。

1.2 鸡组织RNA的提取及WNT6基因表达水平的荧光定量PCR(qPCR)检测

采用传统Trizol试剂法(TaKaRa)提取总RNA,利用TaKaRa的反转录试剂盒反转录成cDNA。反应体系:1 000 ng 总RNA、反转录酶 4 μL,加去离子水至 20 μL;反应条件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。合成cDNA之后用分光光度计检测cDNA浓度,再使用ddH2O将其稀释至400 ng·μL-1后-20 ℃保存备用。根据 GenBank中收录的鸡相关基因mRNA序列,用 Primer Premier 5.0软件设计引物,以β-actin基因为内参,利用ABM RT-qPCR试剂,按照李佳宜等[13]的方法测定蛋鸡各组织内WNT6基因表达水平。引物信息见表1。

表1 引物对序列信息Table 1 Primer pairs sequences information

1.3 鸡WNT6基因过表达质粒的构建与siRNA合成

根据NCBI发布的鸡WNT6基因的mRNA序列(NM_001007594.2),利用 Primer Premier 5.0软件设计全长 CDS 区的扩增引物,引入EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切位点,再连接到 pcDNA3.1真核表达载体上,并将其命名为pcDNA3.1-WNT6。构建好的质粒经双酶切鉴定无误后,送擎科生物技术有限公司测序。由上海吉玛公司设计并合成3条WNT6-siRNA与1条作为阴性对照的NC-siRNA。siRNA命名与序列信息见表2。

表2 siRNA 序列Table 2 sequences of siRNA

1.4 鸡卵泡颗粒细胞分离与体外培养

颈部放血屠宰300日龄产蛋母鸡,用稀释后的84消毒液浸泡母鸡1～2 min,用剪刀剖开腹腔,从右侧完整取出卵巢放入37 ℃预热的PBS中。依次取出单个卵泡放入盛有少量预热PBS的培养皿中,用剪刀和镊子将卵泡轻轻戳破一个小口,并沿着破口向一个方向将卵泡扯开后“倒扣”在培养皿中,用PBS稍微浸泡,可见膜层与颗粒层有分开趋势,用剪刀和镊子将卵泡膜层和颗粒层完整分离。将分离出的颗粒层在培养皿中用PBS涮洗2遍,洗净卵黄,在剪切板上剪碎后用移液器转移至15 mL离心管,再加入2～3 mL 0.1%Ⅱ型胶原酶(Sigma),37 ℃水浴锅消化10 mim左右。期间注意颠倒混匀,无肉眼可见块状后结束消化。消化结束后加入等体积冷的M199完全培养基(2～3 mL)停止消化,混匀,过滤后1 000 r·min-1离心 5 min,倒掉上清液。再用PBS洗净2次后将颗粒细胞用含5%FBS(Gbico)和1%双抗的M199培养基重悬,按照5×106mL-1的密度将原代颗粒细胞铺入6孔或96孔细胞培养板。在37 ℃、5% CO2培养箱中预培养16～24 h,待细胞贴壁后进行后续处理。

1.5 WNT6基因过表达载体与siRNA转染鸡颗粒细胞

当6孔板内颗粒细胞铺满培养孔底60%时,将旧培养基换为无血清培养基,使用LipofectamineTM2000转染试剂按照说明书瞬时转染体外培养的鸡颗粒细胞。转染6 h后,更换正常培养基继续培养。转染共 6组,分别是pcDNA3.1-WNT6、pcDNA3.1、WNT6-siRNA-229、WNT6-siRNA-489、WNT6-siRNA-759以及 NC-siRNA 组。每组3个重复孔。

1.6 卵泡刺激素(FSH)处理颗粒细胞

将体外培养的颗粒细胞贴壁培养24 h后,吸去旧培养基,加入新的M199完全培养基后分为4组,添加梯度稀释的FSH,各组FSH的最终含量分别0、1、10和100 ng·mL-1。每组3个重复孔。

1.7 CCK-8法测定细胞活力

转染换液24 h后采用CCK-8试剂盒检测各处理组与对照组细胞的活力。吸出旧培养基,用预热过的PBS清洗2次,每孔加入90 μL完全培养基和10 μL CCK-8溶液;放入37 ℃培养箱培养3 h;测定D450值。进行3次重复试验,取平均值。

1.8 ELISA检测类固醇激素孕酮(P4)含量

转染换液24 h后,用移液器收集细胞培养液,1 000 r·min-1离心5 min后取上清液于-20 ℃保存,用于P4检测。使用南京奥青公司的鸡P4 ELISA试剂盒检测细胞培养液中P4含量。

1.9 RT-qPCR检测体外培养颗粒细胞基因的表达

将各组体外培养的颗粒细胞按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA,再参照反转录说明书反转录合成 cDNA,qPCR检测目的基因表达水平,通过内参基因β-actin校正后,用2-ΔΔCT法计算各目的基因相对表达量。

1.10 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 海兰蛋鸡各组织WNT6 基因 mRNA表达特征

如图1-A所示:WNT6 mRNA在F1—F5卵泡颗粒层组织中表达量显著高于其他器官组织(P<0.05),WNT6在卵巢和肌肉等组织内也有部分表达,且在心、肝、肾、肠道等其他组织表达量很低。WNT6 mRNA在F1—F5排卵前卵泡膜层组织中表达量也最低。如图1-B所示:WNT6在卵泡发育过程中表现为先升高后降低的趋势,且在小黄卵泡和F5时期具有最高表达水平(P<0.05),提示WNT6在卵泡发育与卵泡选择过程中可能起重要作用,可作为潜在的卵泡选择调控基因。

图1 300日龄海兰蛋鸡各组织(A)和卵泡发育不同阶段颗粒细胞(B)中WNT6表达规律Fig.1 The expression pattern of WNT6 in various tissues(A)and granulosa cells at different stages of follicular(B)of 300 day-old Hyline-brown layer A. K:肾脏Kindey;L:肝脏Liver;Li:大肠Large intestine;Lu:肺Lung;O:输卵管Fallopian tube;Sp:脾脏Spleen;OV:卵巢Ovary;GC:卵泡颗粒层细胞Granulosa cells;TC:卵泡膜层细胞Follicular membranous cells;Bm:胸肌Breast muscle;Tm:腿肌Leg muscle;H:心脏Heart.B.SWF:小白卵泡Small white follicle;LWF:大白卵泡Large white follicle;SYF:小黄卵泡Small yellow follicle. F1—F5:直径1～5 mm的小卵泡Small follicles with a diameter of 1-5 mm.

2.2 WNT6基因的过表达与敲减效率

构建WNT6基因过表达载体,并设计了3条siRNA,用于对颗粒细胞WNT6的过表达和敲减处理。结果如图2所示:过表达质粒可以在宿主细胞内稳定表达,颗粒细胞内WNT6 mRNA表达水平提高了102.3倍(P<0.01);在3条siRNA中WNT6-siRNA-229和WNT6-siRNA-489敲减效率在50%以下(P<0.01),可以用于后续试验。其中,WNT6-siRNA-229的敲减效果最好。

图2 WNT6的过表达与敲减效率的验证Fig.2 Verification of WNT6 overexpression and knockdown efficiency*P<0.05,**P<0.01. The same as follows.

2.3 WNT6对颗粒细胞增殖的影响

分别用过表达质粒和siRNA对颗粒细胞WNT6进行过表达和敲减处理,然后使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性。结果如图3所示:过表达WNT6后颗粒细胞增殖能力极显著提高,增殖能力提升了40.6%(P<0.01);敲减WNT6后颗粒细胞增殖被抑制,增殖能力降低了31%以上(P<0.01)。综上所述,在海兰蛋鸡卵泡发育过程中,WNT6是一个促进颗粒细胞增殖的关键基因。

2.4 WNT6对类固醇激素P4合成及相关基因表达的影响

从图4可知:过表达后颗粒细胞P4产量极显著提高(P<0.01),而对WNT6进行敲减之后颗粒细胞P4含量显著减少(P<0.01)。过表达WNT6之后类固醇合成关键基因CYP11A1、CYP19A1、StAR和HSD3B1的表达水平均极显著提高(P<0.01)。而WNT6敲减后颗粒细胞合成类固醇激素相关基因CYP11A1、CYP19A1和StAR表达水平显著降低(P<0.05)。这些结果表明,WNT6可以通过提高类固醇合成关键基因的表达水平促进颗粒细胞合成类固醇激素。

图3 WNT6过表达与敲减对颗粒细胞增殖活性的影响Fig.3 Effects of WNT6 overexpression and knockdown on the proliferation of granulosa cells

图4 WNT6过表达与敲减对颗粒细胞孕酮(P4)合成(A)及相关基因表达(B、C)的影响Fig.4 Effects of WNT6 overexpression and knockdown on progesterone(P4)synthesis(A) and related gene expression(B,C)in granulosa cells

图5 WNT6过表达与敲减对FSHR基因表达水平的影响Fig.5 Effects of WNT6 overexpression and knockdown on FSHR gene expression level

2.5 WNT6对卵泡选择关键基因FSHR的影响

从图5可知:过表达WNT6极显著提高颗粒细胞FSHR基因表达水平(P<0.01),敲减WNT6极显著降低颗粒细胞FSHR基因表达水平(P<0.01)。结果提示,WNT6通过调控卵泡选择关键基因FSHR的表达影响颗粒细胞增殖与功能。

图6 卵泡刺激素(FSH)对WNT6(A)及WNT通路其他关键基因(B)表达的影响Fig.6 Effects of follicle stimulating hormone(FSH)on the expression level of WNT6(A) and other key genes(B)in the WNT pathway

2.6 FSH对WNT通路主要基因表达的调控

如图6-A所示:FSH可以提高WNT6 mRNA表达水平,并且WNT6 mRNA表达水平随FSH浓度升高而增加。如图6-B所示,FSH还可以显著提高LRP1表达水平(P<0.05),并极显著降低FOXO1的表达水平(P<0.01)。此结果表明WNT6基因的表达呈剂量依赖性受FSH调控,FSH还可通过影响LRP1、FOXO1等基因的表达来调控蛋鸡卵泡颗粒细胞的WNT信号通路。

3 讨论

WNT6首先在非洲爪蟾中被检测到,此外在人、家禽、小鼠、果蝇和非洲文昌鱼等物种[14]中陆续被发现。WNT信号通路参与多种生物学过程[15],最近的研究发现WNT信号通路对卵巢和卵泡发育非常重要[16]。本研究对WNT6在蛋鸡组织表达模式进行探究,发现WNT6在卵泡颗粒细胞内表达量极高,此外在肌肉、卵巢等组织内也有一定表达量,但都远远低于颗粒细胞表达水平。之前研究发现湖羊WNT6 mRNA主要表达于子宫内膜、卵巢、输卵管[17]。虽然他们未对颗粒细胞内WNT6表达水平进行检测,却有其他研究证明大鼠颗粒细胞内有WNT2和WNT4 mRNA表达[18]。本研究中还发现蛋鸡卵泡颗粒细胞内WNT6 mRNA 表达量随卵泡发育阶段的变化而改变,其变化趋势与FSHR高度一致,都随着卵泡发育阶段呈先升高后降低趋势,且在卵泡选择时期具有最高表达水平[19]。总之,这些结果都提示WNT6与其所在的WNT信号通路参与卵泡选择的调控。

在动物胚胎发育的过程中,WNT通路主要与细胞的增殖及分化密切相关[20]。本研究发现,过表达WNT6促进鸡卵泡颗粒细胞的增殖,而敲减WNT6抑制鸡颗粒细胞的增殖。这与Wang[21]等的发现一致,他们发现WNT2敲除的颗粒细胞增殖受到抑制,PCNA显著减少,而过表达WNT2促进颗粒细胞的增殖。Wang 等[22]的最新研究也发现抑制蛋鸡颗粒细胞WNT信号会引起颗粒细胞的增殖抑制。WNT6对细胞增殖的影响也已有研究,在人结肠癌的发展的过程中,WNT6促进癌细胞的增殖,加速细胞周期[23]。总之,本试验结果与前人结论一致,即WNT6促进鸡卵泡颗粒细胞增殖。类固醇激素是卵泡发育过程中的重要调控因素,P4主要由排卵前卵泡中颗粒细胞产生[24-25],由StAR、CYP11A1及3β-HSD三种关键酶将胆固醇在线粒体上转运催化合成的[26-27]。WNT4通过调节类固醇生成酶基因StAR、CYP19A1和CYP11A1表达促进鸡卵泡颗粒细胞合成类固醇激素[3,28]。本研究结果证明WNT6与其他WNT配体功能相似,提高鸡颗粒细胞内类固醇合成基因的表达并提高体外培养颗粒细胞内P4合成量。

FSH可直接通过WNT信号通路影响相关基因的表达。Gupta等[29]发现,经FSH处理后,体外培养的牛卵巢颗粒细胞内,其WNT信号通路中的FZD2、CTNNB1等基因的表达量显著上调。此外,目前已知FSH可以通过PI3K/Akt途径和PKA途径激活WNT通路[30-32]。本试验结果显示,FSH以浓度依赖性提高体外培养的鸡卵泡颗粒细胞的WNT6 mRNA表达水平,并显著影响LRP1和FOXO1基因表达水平。另外,WNT信号可协同FSH调控卵泡发育过程。有研究发现抑制经典WNT信号通路可抑制颗粒细胞对FSH的反应性[16]。本研究发现,过表达WNT6提高颗粒细胞内FSHR基因表达水平,而敲减WNT6则降低FSHR基因表达水平,表明WNT6可以提高颗粒细胞对FSH的反应性。总之,这些结果证明WNT信号从多个方面介导FSH对卵泡发育的调控。WNT6可以通过促进颗粒细胞增殖与P4合成促进卵泡发育,并通过提高颗粒细胞FSHR表达水平提高颗粒细胞对FSH的反应性,协同FSH参与卵泡选择调控。