喷施铜和硼肥对忍冬生长生理及金银花品质的影响

彭雅萍,张佳钰,苏煜楹,孙莉琼,刘仙华,唐晓清*,廖治明,王康才

(1.南京农业大学园艺学院,江苏 南京 210095;2.江西峡江南农园农业发展有限公司,江西 峡江 331400)

金银花为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或带初开的花,清热解毒,疏散风热。用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温热等[1],还具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤作用[2-4]。我国从2005年全面实施测土配方施肥项目以来,微量元素营养调控就开始成为现代高效集约化农业必不可少的技术措施之一[5]。目前,对忍冬的研究主要集中在氮、磷、钾配方施肥对其产量及质量的影响[6]。

微量元素在药用植物次生代谢物合成与积累中起着重要作用,影响药材的内在质量[7]。崔志伟等[8]研究发现,施用铜和锌元素可使忍冬碳水化合物代谢、蛋白质代谢等生理活动更加活跃,也可增加其指标成分含量。Lahijani 等[9]研究发现,叶面喷施微量元素可有效提高水稻对微量元素的吸收利用;铜有稳定植物体内有关化合物的作用[10],也影响糖在植物体内的转运[11]。硼参与植物碳水化合物的运转,植物缺硼时,糖分运输受到抑制。马光恕等[12]研究发现适宜浓度的硼砂叶面喷施处理能够有效促进马铃薯块茎淀粉的合成与积累,改善其相关品质。硼肥也对改善药用植物品质具有重要作用[13],例如陈雨等[14]研究发现叶面喷施硼肥对瓦布贝母的增重率和总生物碱含量均具有显著性影响;胡华峰等[15]研究发现喷施微肥能促进苜蓿多种微量元素的含量及积累量的增加。目前铜与硼肥对忍冬花蕾生长与金银花品质影响的相关报道较少。

因此,本试验采用叶面喷施的方法,研究铜、硼肥对忍冬叶片的光合色素、忍冬花蕾的生长指标及金银花营养、药用成分及矿质离子等生长生理与品质的影响,探索铜、硼肥配施的最佳组合,以期为优化忍冬栽培技术提供试验参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

供试材料选自山东临沂基地的忍冬种苗,经南京农业大学王康才教授鉴定为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)2年生苗。硫酸铜(CuSO4·5H2O)、四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)(纯度≥99%)等试剂均为分析纯,乙腈为色谱纯。

UV-1800型紫外可见分光光度计购自上海美谱达仪器有限公司;Waters UPLC超高效液相色谱仪购自江苏微思医药科技有限公司;Eppendorf Centrifuge 5810R离心机购自无锡莱弗思生物实验器材有限公司;MARS6微波消解仪购自南京滨正红仪器有限公司;ICAP等离子体发射光谱仪购自赛默飞世尔公司。

1.2 试验地概况

试验地点为江西峡江南农园金银花种植基地,该地土壤类型为红壤。在试验进行前,取0～20 cm的土壤测定其理化性质。其中:pH值为5.86,有机质含量为14.2 g·kg-1,全氮含量为1.88 g·kg-1,全磷含量为0.86 g·kg-1,全钾含量为37.6 g·kg-1,铜含量为3.34 mg·kg-1,硼含量为2.23 mg·kg-1,且铜、硼含量远低于全国95%土壤的铜、硼含量,属于极度缺乏铜、硼元素土壤。

1.3 试验设计

采用叶面喷施方式。基于铜(Cu)、硼(B)两因素,设置6个浓度水平,共16个处理的双因素试验方案。选用长势大体一致的忍冬植株,小区面积12 m×0.8 m,区间距40 cm,株、行距均为25 cm。铜和硼肥分别为10、30、50 mg·L-1的硫酸铜溶液和20、40、60 mg·L-1的四硼酸钠溶液,分别用Cu1、Cu2、Cu3和B1、B2、B3表示,以喷施清水作为对照(CK),采用单施与配施方法处理(表1),共16个处理,每个处理15株。忍冬开花前一个月即2021年3月27日开始处理,于下午15:00进行喷施,以叶片正反两面全部湿润且无滴下为宜,每隔7 d喷施1次,共喷施4次。处理期间其他管理措施保持一致。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 生长指标忍冬花蕾采收后,各处理均选取100个花蕾测定其长度及干、鲜重。

1.4.2 生理指标光合色素:选取忍冬植株最顶端的叶片测量各处理的光合色素含量。以95%乙醇提取法[16]测定忍冬最顶端叶片的光合色素。

营养成分:可溶性糖含量采用蒽酮比色法[16]测定,淀粉、可溶性蛋白以及还原糖含量均采用南京建成生物研究所试剂盒测定。

表1 铜、硼肥处理浓度和设置Table 1 Treatment concentrations and designs of copper and borax fertilizer

1.4.3 品质指标样品处理:忍冬花蕾105 ℃杀青5 min,置于40 ℃烘箱中烘干至恒重,粉碎后过孔径为0.18 mm筛。

1)酚酸类成分。对照品溶液制备:精密称量绿原酸对照品、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品,置棕色量瓶中,加75%甲醇分别配制成0.28、0.15 mg·mL-1和44 μg·mL-1的溶液。供试品溶液的制备:精密称量供试品粉末0.5 g,置于具塞锥形瓶中,加入75%甲醇50 mL,称量,超声处理(功率500 W,频率40 kHz)30 min,放冷,再称量后用75%甲醇补足减失质量,摇匀后过滤,取滤液。色谱条件:C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm),流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液,进样体积为2 μL,检测波长为 327 nm,流速为0.7 mL·min-1,柱温25 ℃。分别以各酚酸类成分的色谱峰面积(Y)与其对应的含量(X,mg·L-1)作标准曲线,得回归方程:绿原酸:Y=281.49X-311.4,R2=0.998 1(n=3),线性范围:0～0.89 mg·mL-1;异绿原酸A:Y=210.81X-204.27,R2=0.999 7(n=3),线性范围:0～0.24 mg·mL-1;异绿原酸C:Y=838.54X-905.7,R2=0.998 7(n=3),线性范围:0～0.078 mg·mL-1。

2)木犀草苷。对照品溶液制备:精密称量木犀草苷对照品,加70%乙醇制成40 μg·mL-1的溶液。供试品溶液制备:精密称量供试品粉末2 g,置于具塞锥形瓶中,加入70%乙醇50 mL,称量,超声处理(功率250 W,频率35 kHz)1 h,放冷,再称量,并用70%乙醇补足减失质量,摇匀后过滤。量取滤液10 mL,回收溶剂至干,残渣用70%乙醇溶解,转移至5 mL量瓶中,加70%乙醇至刻度。色谱条件:C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm),流动相为乙腈-0.5%冰醋酸溶液,进样体积为10 μL,检测波长为350 nm,流速为 0.7 mL·min-1,柱温25 ℃。以木犀草苷的色谱峰面积(Y)与其对应的含量(X,mg·L-1)作标准曲线,得回归方程:Y=269.24X-301.42,R2=0.997 8(n=3),线性范围:0～0.44 mg·mL-1。

总黄酮:采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[16],测定波长为510 nm,测定并计算样品中总黄酮的含量。

1.4.4 矿质离子样品消解:采用微波消解法。所有器皿均在10%硝酸中浸泡24 h后用去离子水洗净,烘干备用。精密称取0.3 g干样于内插管中,加入5 mL HNO3,轻摇使其混合均匀,盖好内插管盖后放入微波消解罐中消解30 min,冷却后开罐,用去离子水将消解液定容至50 mL,混匀后备用。样品测定采用ICAP 7000等离子体发射光谱仪,射频功率1 150 W,辅助器流量0.5 L·min-1,等离子体气流量12 L·min-1,蠕动泵转速50 r·min-1。

1.5 数据分析

2 结果与分析

2.1 铜、硼肥对忍冬叶片光合色素的影响

由表2可见:单施铜肥时,忍冬叶片的叶绿素a和叶绿素b含量随着铜肥浓度的增加呈上升趋势,其中Cu3处理的叶绿素a和b含量比CK处理显著增加(P<0.05),分别为1.78和0.63 mg·g-1。单施硼肥时,叶片叶绿素a和叶绿素b含量随着硼肥浓度的增加呈先升高再降低的趋势,其中B2处理的叶绿素a和b含量最高,分别为1.66和0.59 mg·g-1,说明一定浓度的硼可增加忍冬叶片中叶绿素a和b含量。配施铜、硼肥时,随着铜、硼肥浓度的增加,叶片叶绿素a和b含量均呈先下降后上升再下降的趋势,其中B1Cu1处理叶绿素a和b含量最高,分别为1.68和0.58 mg·g-1,而B3Cu3处理的叶绿素a和b含量最低,分别为1.14和0.40 mg·g-1。

表2 不同铜、硼肥处理对忍冬叶光合色素的影响(n=3)Table 2 Effects of different copper and borax fertilizer treatments on the photosynthetic pigment of leaves in Lonicera japonica(n=3)

2.2 铜、硼肥对忍冬花蕾生长指标的影响

由表3可知:单施硼肥时,忍冬花蕾长度随着硼肥浓度的增加呈先上升后下降的趋势,其中B2处理花蕾长度比CK增加了3.59%,且差异显著;B1处理的百花蕾鲜重最大,表明适宜浓度的硼肥可以显著增加忍冬花蕾的长度,单施铜肥时,忍冬花蕾的长度和百花蕾鲜重均呈先上升后下降的趋势。配施铜、硼肥时,各处理之间忍冬花蕾的长度无显著差异(P>0.05);B1Cu2处理百花蕾鲜重最大,为13.60 g,比CK显著增加22.21%。

表3 不同铜、硼肥处理对忍冬花蕾生长指标的影响(n=100)Table 3 Effects of different copper and borax fertilizer treatments on growing index of buds in L. japonica(n=100)

2.3 铜、硼肥对金银花主要成分的影响

由表4可见:除Cu2和Cu3处理外,单施铜肥或硼肥,金银花可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉、还原糖、总黄酮含量均较CK高。单施铜肥时,可溶性蛋白、可溶性糖、还原糖、总黄酮含量随着铜肥浓度的增加呈下降趋势,即Cu1处理含量最高,而淀粉含量则是Cu3处理最高,为185.79 mg·g-1;单施硼肥时,可溶性蛋白与淀粉含量随着硼肥浓度的增加,其含量呈先上升后下降的趋势,即B2处理可溶性蛋白和淀粉含量最高,分别为0.91和196.32 mg·g-1,而可溶性糖含量随着硼肥浓度的升高呈下降的趋势,即B1处理最高,为0.88 mg·g-1;还原糖含量以B3处理最高,为1.15 mg·g-1,总黄酮含量B1处理最高,为19.74 mg·g-1。

与CK相比,配施铜、硼肥处理金银花中可溶性蛋白含量均呈下降趋势,最低为B2Cu1处理,仅为0.05 mg·g-1,比CK减少81.18%;可溶性糖含量均呈上升趋势,且配施铜、硼肥比单施处理含量增加显著;淀粉含量在B1、B2、B3处理下,随着铜肥浓度的增加,呈先上升后下降的趋势,但随着硼肥浓度的增加,其含量也有所下降,其中B1Cu2处理淀粉含量最高,为179.65 mg·g-1,比CK增加21.18%;还原糖含量在B1、B2处理下,随着铜肥浓度的增加呈先上升后下降的趋势,而在B3处理下,呈下降的趋势,以B3Cu3含量最低,仅为0.003 mg·g-1,表明高浓度的铜肥对还原糖有显著的抑制作用。

表4 不同铜、硼肥处理对金银花主要成分的影响(n=3)Table 4 Effects of different copper and borax fertilizer treatments on major constituents in Lonicerae japonicae flos(n=3)

2.4 铜、硼肥对金银花药用成分的影响

由表5可见:单施铜肥时,金银花中绿原酸、木犀草苷含量随着铜肥浓度增加呈不断下降的趋势,以Cu1处理的含量最高,分别为0.70、0.44 mg·mL-1。异绿原酸A和C的含量随着铜肥浓度的增加呈先上升后下降的趋势,以Cu2处理的含量最高,分别为0.18和0.046 mg·mL-1;单施硼肥,绿原酸含量随着硼肥浓度增加而上升,以B3浓度处理的含量最高,为0.89 mg·mL-1,而木犀草苷含量随着硼肥浓度增加而下降,以B1处理的含量最高,为0.35 mg·mL-1,异绿原酸A和C的含量随着硼肥浓度的增加,呈先上升后下降的趋势,以B2处理的含量最高,分别为0.21和0.045 mg·mL-1。

配施铜、硼肥时,绿原酸、酚酸类成分和木犀草苷含量在B1、B2、B3浓度下,均随着铜肥浓度的增加呈下降趋势,以B3Cu1处理的含量最高,分别为1.00、1.28和0.30 mg·mL-1,比CK增加78.21%、83.91%和30.40%。

表5 不同铜、硼肥处理对金银花中药用成分的影响(n=3)Table 5 Effects of different copper and borax fertilizer treatments on medicinal ingredient in Lonicerae japonicae flos(n=3)

2.5 铜、硼肥对金银花矿质离子含量的影响

由表6可见:不同浓度铜、硼肥对金银花中Fe3+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、B3+含量有影响。单施铜肥时,金银花中Fe3+含量随着铜肥浓度的增加呈上升趋势,其中Cu3处理的Fe3+含量最高,为3.12 mg·kg-1,比CK增加86.06%;Mn2+、Zn2+含量呈先上升后下降的趋势,Cu2处理的含量最高,分别为0.048、0.75 mg·kg-1。单施硼肥时,Fe3+含量随着硼肥浓度的增加呈下降趋势,其中B1处理的Fe3+含量最高,为3.60 mg·kg-1;Zn2+含量随着硼肥浓度的增加呈先上升后下降的趋势,以B2处理的含量最高,为0.53 mg·kg-1,表明高浓度的硼肥会抑制金银花对Fe3+、Zn2+的吸收。配施铜、硼肥时,B1Cu2处理Fe3+含量最高,为4.83 mg·kg-1,比CK显著增加187.91%;B2Cu2处理的Mn2+含量最高,为0.145 mg·kg-1,比CK显著增加22.88%;B2Cu3处理Zn2+含量最高,为1.11 mg·kg-1,比CK显著增加124.80%。

单施铜肥时,Cu2+含量随着铜肥浓度的增加呈上升趋势,以Cu3处理含量最高,B3+含量除Cu2处理外也有明显的增加。单施硼肥时,Cu2+和B3+含量随着硼肥浓度的增加呈下降的趋势,说明高浓度硼不利于Cu2+和B3+的吸收。配施铜、硼肥,在B1和B2浓度时随着铜肥浓度的增加,Cu2+含量呈上升趋势,而B3+含量则呈先上升后下降的趋势,以B2Cu3处理的Cu2+含量最高,B1Cu2处理的B3+含量最高;在B3浓度时,Cu2+和B3+含量均呈先下降后上升的趋势,其中B3Cu3处理的Cu2+含量最高,为0.94 mg·kg-1。总体上看,配施铜、硼肥比单施效果要好,表明配施铜、硼肥比单施铜肥或单施硼肥更能促进金银花对矿质离子的吸收。

表6 不同铜、硼肥处理对金银花矿质离子含量的影响(n=3)Table 6 Effect of different copper and borax fertilizer treatments on the mineral ion contents in Lonicerae japonicae flos(n=3)

3 讨论与结论

微肥为植物生长发育提供必需的营养元素,对植物生长有重要影响。本研究发现,喷施一定浓度的硼肥有助于提高忍冬花蕾的长度,尤以B2处理最佳。除B3Cu3处理总叶绿素含量较CK有所下降外,其余处理均比CK上升,以Cu3处理最佳,表明适宜浓度的铜、硼肥可促进忍冬叶叶绿素的增加,而硼、铜过量时则抑制叶绿素的合成。研究表明,过量铜和硼会使叶绿体类囊体基粒片层减少,叶绿素含量减少[17-18],本研究结果与之一致。

碳氮代谢为植物体内最基本的生理代谢过程,其代谢强度和协调程度决定植物的生长、发育及代谢能力[19-20]。本研究中,金银花中可溶性蛋白含量随硼浓度增加呈先上升后下降的趋势,在硼肥达40 mg·L-1时,可溶性蛋白含量显著提高。一定浓度的铜肥对忍冬的生理代谢有显著促进作用,但过量的铜会对其产生毒害。当铜肥浓度达到30 mg·L-1时,金银花中的可溶性蛋白含量显著降低。研究表明随着Cu2+浓度的增加,千屈菜无菌苗的可溶性蛋白表现为低促高抑现象[21],本研究结果与之相一致。喷施铜、硼肥后,金银花中可溶性糖含量比CK增加,说明铜、硼肥对忍冬体内可溶性糖积累有促进作用,其中Cu2+对可溶性糖的影响较显著。喷施铜、硼肥后金银花中淀粉和还原糖含量比CK普遍增加,但高浓度的铜、硼肥会抑制还原糖的产生。研究发现,充足的B和Cu对维持生菜、茼蒿叶片功能起着重要作用,缺B和Cu会使其体内叶绿素含量下降,影响碳水化合物的合成[22],本试验的研究结果与之一致。

绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、木犀草苷和总黄酮是金银花主要次生代谢产物,其含量高低是评价金银花质量的重要标准。Campa 等[23]认为咖啡中的绿原酸主要有2条合成途径,即莽草酸和咖啡酸途径。在烟草中,绿原酸合成途径中涉及的关键酶苯丙氨酸解氨酶(PAL),在缺B元素时会影响植株体内PAL活性,进而影响绿原酸的合成[24]。因此,喷施硼肥必然会对绿原酸以及黄酮类物质合成产生影响。本研究发现,适宜浓度的铜、硼配施可有效提高金银花中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、木犀草苷和总黄酮含量。

矿质元素在人体生命过程中有着极其重要的作用[25]。铁是人体内含量最高的必需微量营养元素[26],当摄入不足时,会导致缺铁性贫血等代谢紊乱[27];人体缺铜时赖氨酸氧化酶活性降低,会增强血管及组织的脆性,易造成血管破裂出血[28]。人体含锰正常范围为12～20 mg[29],肝癌病人体内的锰含量比正常人的明显偏低,说明锰有一定的防癌作用[30]。锌是人体中代谢最广泛的元素,锌缺乏会使酶的活性下降,从而影响人体许多系统的正常功能[31]。硼影响人体中钙、铜、镁、氮等许多物质的代谢,并因此影响着血、脑、肾、骨骼系统的成分和功能[32]。矿质元素同样也是植物维持正常生长、新陈代谢必需的营养元素[33]。本研究发现,除Mn2+外,单施与配施铜、硼肥,金银花中矿质离子含量普遍增加,其中配施铜、硼肥比单施铜或硼肥增加效果显著,尤以B1Cu2最佳。公勤等[34]研究表明,低浓度Cu2+处理(50 mg·kg-1)可显著增加菠菜体内的Cu2+含量,但是植物能够主动调节抗氧化系统以抵御胁迫伤害,促进微量元素吸收,而高浓度Cu2+胁迫(1 000 mg·kg-1)导致菠菜体内Cu2+含量平均增至对照的105倍,此时植物通过调节体内抗氧化系统已很难抵御高浓度Cu2+胁迫伤害,抑制矿质元素吸收。本试验中,Cu2+浓度为低浓度处理,未达到抑制矿质离子吸收的浓度,因此各处理均比CK处理促进了微量元素的吸收。

综上所述,喷施适宜浓度的铜、硼肥有利于提高忍冬叶的叶绿素含量,增强其光合作用,促进其生长,增加忍冬花蕾的长度和鲜干重以及金银花营养和药用成分含量,从而提高其品质,以B2、B1Cu2、B3Cu1处理最佳。单施与配施铜、硼肥,金银花微量元素含量除Mn2+外均有增加,其中配施铜、硼肥比单施增加效果显著,以B1Cu2处理最佳。综上,B1Cu2处理的忍冬花蕾生理指标及金银花营养和药用成分含量均高于其他处理,研究结果为合理利用铜、硼肥、优化忍冬栽培技术和提高其药材品质提供了理论参考。