基于四极杆-线形离子阱串联质谱技术测量血清25OHD

谢 洁，易可可，高文静，刘 浩，李家练，黄泽建，刘梅英，余青霓，王涵文，江 游，戴新华，方 向

(1.中国计量科学研究院前沿计量科学中心，国家市场监管技术创新中心(质谱)，北京 100029；2.常州磐诺仪器有限公司，江苏 常州 213163；3.安徽砺沐医疗器械有限公司，安徽 六安 237001)

维生素D(Vitamin D,VD)对于人体健康至关重要，缺乏VD会导致儿童佝偻病，成人骨质减少、骨质疏松和骨折等症状，而且还与癌症[1-2]、心血管疾病[3-4]、糖尿病[5]等多种疾病相关。因此，分析评估人体VD水平至关重要[6]。VD在肝脏中主要转化为25-羟基维生素D(25-hydroxy vitamin D,25OHD)，因为其含量高于其他代谢物，且半衰期为2～3周，相对稳定，所以25OHD2和25OHD3被认为是评价人体VD水平的可靠指标[7]。临床上，血液循环系统内的25OHD浓度大于20 g/L即为正常[8-11]。由于VD缺乏症在全世界各年龄组中普遍存在[12]，对VD及其代谢物的分析需求急剧增加，准确测量人血清中25OHD含量具有重要意义。

在25OHD临床分析中，液-液萃取[13]操作简便、结果较稳定，是常用的前处理方法，除此之外，还有固相萃取[14]、分散液-液微萃取[15]等方法。25OHD的检测方法主要有免疫法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)。其中，LC-MS/MS具有高准确度、高灵敏度和高特异性的特点，是国际公认的测定25OHD的“金标准”[16-22]。目前，LC-MS/MS主要基于三重四极杆(QqQ)串联质谱技术，该技术和产品被国外仪器厂商垄断，并形成系列专利保护，给国产质谱仪器的发展造成极大阻碍。近年来，杭州聚光科技公司和天津国科公司均开发了拥有自主知识产权的三重四极杆质谱技术和装置。其中，杭州聚光科技公司研制的Expec-5210型三重四极杆质谱仪已用于农兽药残留、真菌毒素、环境污染物和临床标记物等样本的分析[23]；天津国科公司研制的面向临床检验的LC-HTQ 2020型液相色谱-三重四极杆质谱仪已用于人血清中VD检测，能够满足VD临床检测的要求[24]。这两家公司自主研制的仪器先后在2022年和2021年获批医疗器械注册证，对打破国外仪器厂商对国内医疗质谱仪器的垄断，降低医疗成本支出，推动国产质谱仪器的发展起到积极作用。

离子阱质谱具有构造简单、灵敏度高的特点，但存在线性范围窄、空间电荷效应等问题[25-26]，因此，限制了其分析复杂基质样本中痕量物质。为解决该问题，中国计量科学研究院-国家市场监管技术创新中心(质谱)研发了一种新型的四极杆-线形离子阱质谱装置与技术[27]。与三重四极杆串联质谱的四极杆1-碰撞池-四极杆3的轴向耦联技术不同，该装置为四极杆-线形离子阱直接轴向耦联设计，即用单个线形离子阱代替三重四极杆后端的碰撞池-四极杆3，在保持准确定量的基础上精简了质量分析器结构，同时具有离子阱质量分析器的高灵敏度优势，其结构原理示于图1。该技术分析原理是通过四极杆筛选目标母离子，在线形离子阱中实现母离子存储、碎裂，子离子富集、扫描，有效降低了复杂基质中高丰度杂质离子对痕量或超痕量目标离子的空间电荷干扰，显著提高了离子阱分析复杂基质样本的定量能力。在此技术的基础上，本团队研制了QLIT-6610MD液相色谱-串联质谱系统的产品样机。

本研究采用四极杆-线形离子阱液相色谱-质谱联用法测量血清中25OHD，结合国产试剂盒，建立同位素稀释质谱定量分析方法。经方法确证后，开展批量实际临床样本的定量分析研究，并与商品化的三重四极杆串联质谱仪的测量结果进行对比，以期为临床质谱分析提供一种新的仪器方案，助力国产质谱技术和应用的快速发展。

图1 四极杆-线形离子阱串联质谱仪的结构原理[27]Fig.1 Structural principle of quadrupole-linear ion trap tandem mass spectrometer[27]

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

QLIT-6610MD液相色谱-串联质谱系统：安徽砺沐医疗器械有限公司产品；AB 4500MD液相色谱-串联质谱系统：美国AB Sciex公司产品；YS EXACT 9900MD高效液相色谱-串联质谱系统、英盛C18色谱柱：山东英盛生物技术有限公司产品；AL204电子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司产品；5804R型高速冷冻离心机、微量可调移液器：德国Eppendorf公司产品；KB-5010型涡旋仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；N-EVAP 112MA氮吹仪：美国Organomation公司产品；PM4-1300TD型超声仪：英国PRIMA公司产品；DGG-9146A电热恒温鼓风干燥箱：上海精密试验设备有限公司产品；冰箱：韩国LG公司产品；Milli-Q型纯水仪：美国Millipore公司产品；0.22 μm尼龙微孔滤膜：天津市津腾实验设备有限公司产品； Kinetex C18色谱柱：广州菲罗门科学仪器有限公司产品。

25OHD2、25OHD3、d6-25OHD2和d3-25OHD3标准品：纯度均大于99.9%，德国Dr. Ehrenstorfler GmbH公司产品；25-羟基维生素D测定试剂盒(高效液相色谱-串联质谱法，注册证号：鲁械注准20212400136)：山东英盛生物技术有限公司产品；甲醇、乙腈、甲酸、超纯水：均为质谱级，美国Thermo Fisher公司产品；甲酸铵、乙酸铵、氟化铵：均为质谱级，美国Sigma-Aldrich公司产品。

1.2 溶液配制

1.2.1血清样本保存与使用 混合人血清样本量不小于500 μL，并于-80 ℃储存。为保证样品在运输过程中的稳定性，采用干冰运输，使用前在室温下平衡1 h。

1.2.2标准品溶液的配制 准确称取1.00 mg 25OHD2或25OHD3标准品，加入0.5 mL甲醇溶解，振荡混匀。用甲醇稀释成0.01、0.05、0.1、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/L标准品工作液，于-20 ℃避光储存，可稳定保存1个月。

准确称取1.00 mg d6-25OHD2或d3-25OHD3标准品，加入1 mL甲醇溶解，振荡混匀。用甲醇稀释成10 mg/L内标基础工作液和1 mg/L内标工作液，于—20 ℃避光储存，可稳定保存3个月。

1.3 样品前处理

采用山东英盛生物技术有限公司“25-羟基维生素D测定试剂盒(高效液相色谱-串联质谱法)”进行样品前处理，所用的提取液、衍生液、终止液、洗脱液和复溶液等试剂均由该试剂盒提供。也可以根据实际条件采用其他市售有证试剂盒或实验室自建方法。

取100 μL血清至96孔提取板中，依次加入100 μL提取液A、150 μL内标工作液，涡旋振荡混匀1 min，将上述液体全部转移至96孔过滤板中(配96孔收集板)，静置5 min。随后加入1.5 mL提取液C，静置5 min，洗脱液收集于96孔收集板中，于室温下氮气吹干(流量2 mL/min，约5 min)。将60 μL衍生液加入吹干后的残渣中，盖上96孔硅胶垫，50 ℃反应30 min，待冷却后加入40 μL终止液，振荡1 min，氮气吹干，每孔加入100 μL复溶液，振荡混匀2 min。将全部液体转移至96孔进样板中，覆上铝箔封膜，待测。校准品、质控品的制备过程与样品一致。

1.4 LC-MS/MS条件

1.4.1QLIT-6610MD 色谱条件： 英盛C18色谱柱(3.0 μm×50 mm×2.1 mm)；流动相为5 mmol/L氟化铵的0.1%甲酸水溶液(A)和5 mmol/L氟化铵的0.1%甲酸甲醇溶液(B)；流速0.5 mL/min；柱温60 ℃；梯度洗脱程序：0～1 min(60%B)，1～2 min(60%～98%B)，2～3.5 min(98%B)，3.5～4 min(98%～60%B)，4～5 min(60%B)。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式，子离子扫描(QTPIS)；电喷雾电压4 000 V，离子源温度300 ℃，大气压接口温度400 ℃，鞘气3.9×105Pa，辅助气压力1.6×105Pa，反吹气压力1.0×104Pa；离子阱氦气流速1.0 mL/min。其他质谱参数列于表1。

1.4.2AB 4500MD 色谱条件：Kinetex C18色谱柱(2.6 μm×50 mm×3 mm)；柱温40 ℃；流动相、流速和梯度洗脱程序同1.4.1节。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测(MRM)模式；电喷雾电压5 500 V，离子源温度450 ℃，雾化气压力4.1 × 105Pa，辅助加热气压力3.4×105Pa，气帘气压力1.4×105Pa，碰撞解离气压力6.0×104Pa。其他质谱参数列于表1。

1.4.3YS EXACT 9900MD 色谱条件：英盛C18色谱柱(3.0 μm×50 mm×2.1 mm)；柱温40 ℃；流动相、流速和梯度洗脱程序同1.4.1节。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测模式；电喷雾电压4 300 V，离子源温度300 ℃，离子传输管温度300 ℃，鞘气压力3.4 × 105Pa，辅助气压力1.6×105Pa，反吹气压力0 Pa，碰撞诱导解离气压力0.2 Pa。其他质谱参数列于表1。

2 结果与讨论

2.1 LC-MS/MS方法的建立

2.1.1液相色谱法的建立 25OHD作为甾体类化合物，具有环戊烷多氢菲的基本骨架结构。除C、H、O外，甾体类化合物只含有较少的其他原子，因此电离效率低，且电离后表现出较差的、非特征性的碎裂特性。此外，由于存在环戊烷多氢菲的环结构，给予一般的碰撞能较难产生碎片，进一步增加碰撞能可能产生大量丰度较低的非特征产物离子[28]。甲酸、甲酸铵、乙酸铵是常用的提高ESI电离效率的可挥发性添加剂。氟化铵通常用于提高负离子电离效率，有报道[29-30]在流动相中添加氟化铵以促进甾体化合物的正负电离效率，提升灵敏度。为提高25OHD在电喷雾离子源下的电离效率，本研究比较了在流动相体系下添加不同浓度甲酸、甲酸铵、乙酸铵和氟化铵对25OHD响应强度的影响，示于图2。

注：a.甲酸铵；b.乙酸铵；c.氟化铵；25OHD2、25OHD3、d3-25OHD3浓度为25 μg/L，d6-25OHD2浓度为50 μg/L图2 不同流动相对25OHD响应强度的影响Fig.2 Effect of different mobile phases on 25OHD response intensity

可以看出，与仅添加0.1%甲酸相比，在添加0.1%甲酸的基础上添加不同挥发性缓冲盐可以提高25OHD响应强度。具体而言，当向流动相中添加0.5～1.0 mmol/L甲酸铵时，25OHD的响应强度提升14.1%～139.6%，而在相同条件下添加乙酸铵和氟化铵时，响应强度分别提升了11.9%～95.6%和90.3%～432.0%。可见，氟化铵对25OHD响应强度的提升效果总体高于甲酸铵和乙酸铵。此外，随着缓冲盐浓度的增加，响应强度提升的效果发生变化。在向流动相中添加5 mmol/L氟化铵时，25OHD响应强度最高，但当添加浓度为10 mmol/L时，响应强度反而显著下降，这可能是缓冲盐浓度过高导致的。缓冲盐在ESI离子源内得失电荷的能力往往强于待测物，而在源内形成的液滴表面缓冲盐离子过于密集，与待测物形成竞争，使样品中待测物离子难以到达液滴表面从而被辅助气体蒸发形成气相离子，这时待测物响应强度随缓冲盐离子浓度的增加而降低。向流动相中添加0.1%甲酸和5 mmol/L氟化铵后，25OHD响应强度比仅添加0.1%甲酸时显著提高，色谱峰形更尖锐对称。因此，本研究选择添加0.1%甲酸和5 mmol/L氟化铵作为流动相。

2.1.2串联质谱法的建立 为进一步提高25OHD的响应强度，通过外置注射泵在5 μL/min流动注射模式下优化QLIT-6610MD质谱条件，依次改变离子源温度、大气压接口温度、离子透镜电压参数，根据目标子离子的最佳响应强度值选择对应的参数。优化后的提取离子色谱图示于图3。

在对比的商业仪器上建立目标分析物方法的过程如下：在10 μL/min流动注射状态下，通过外置注射泵将标准品或内标溶液注入质谱仪，正离子模式下监控母离子和子离子强度，优化气体流速、离子源温度、去簇电压、碰撞电压、透镜电压和碰撞能量等关键参数，使4种化合物在ESI+下获得最佳的响应值。AB 4500MD和YS EXACT 9900MD条件优化后的提取离子色谱图分别示于图4、5。

注：a.25OHD3；b.25OHD2；c.d3-25OHD3；d.d6-25OHD2图3 QLIT-6610MD的25OHD提取离子色谱图Fig.3 Extracted ion chromatograms of 25OHD by QLIT-6610MD

注：a.25OHD3；b.25OHD2；c.d3-25OHD3；d.d6-250HD2图4 AB 4500MD的25OHD提取离子色谱图Fig.4 Extracted ion chromatograms of 25OHD by AB 4500MD

2.2 方法确证

2.2.1线性关系 以标准品与内标含量的比为横坐标(x)，标准品与内标峰面积的比为纵坐标(y)进行线性回归分析，25OHD2和25OHD3的线性范围分别为0.78～50 μg/L和1.56～100 μg/L，线性方程分别为y=2.528 9x-0.001 63和y=3.830 15x-0.008 89，决定系数R2≥0.999 9。

2.2.2精密度 精密度由变异系数(coefficient of variation,CV)表示。对低、高质控样品重复测定6次，连续测定3天，日内和日间精密度列于表2。结果表明，所有测量结果均在靶值范围内并接近目标值，其中25OHD2和25OHD3的日内和日间精密度范围分别为1.40%～4.06%和0.77%～2.96%。

表1 质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters

表2 方法确证结果Table 2 Results of method validation

注：a.25OHD3；b.25OHD2；c.d3-25OHD3；d.d6-25OHD2图5 YS EXACT 9900MD的25OHD提取离子色谱图Fig.5 Extracted ion chromatograms of 25OHD by YS EXACT 9900MD

2.2.3准确度 准确度由回收率表示。将25OHD2和25OHD3标准品添加至血清样本中，获得低、中、高3个浓度的回收率分析样本，用未添加标准品的血清作为空白组，每个浓度测量3组样本，每组样本重复测定3次，结果列于表2。可见，25OHD2的低、中、高浓度样本回收率分别为108.38%、101.49%和99.25%，CV≤5.10%；25OHD3的低、中、高浓度样本回收率分别为106.80%、107.01%和104.53%，CV≤3.28%。

2.2.4检出限和定量限 以3倍信噪比(S/N)作为检出限(LOD)，10倍信噪比作为定量限(LOQ)，且满足重复测定5次峰面积CV≤15%，结果列于表2。25OHD2和25OHD3的LOD和LOQ分别为0.06、0.02 μg/L和0.12、0.06 μg/L。

2.3 方法验证

使用低、高质控品对所建立的方法进行验证，结果列于表3。3台液质联用仪检测的结果一致，均在靶值范围内，表明所建立的方法准确、可靠。

2.4 实际样本检测

分别采用自主研制的QLIT-6610MD和有证产品AB 4500MD、YS EXACT 9900MD 3台液质联用仪测定50例人血清样品，结果示于图6，25OHD2和25OHD3含量分别在0.12～19.46和6.18～71.23 μg/L范围内。使用Pearson系数分析数据相关性，结果列于表4。可见，QLIT-6610MD和AB 4500MD之间的相关系数R>0.998 0，并呈现P<0.01，表明两者之间存在显著的正相关。同理，QLIT-6610MD和YS EXACT 9900MD，AB 4500MD和YS EXACT 9900MD之间也存在显著的相关性。采用Bland-Altman分析数据一致性，结果示于图7，3组数据界外点数百分比均≤6%，表明数据具有良好的一致性。QLIT-6610MD基于四极杆和线形离子阱直接轴向耦联技术，有效降低了复杂血清样本中杂质离子对25OHD的干扰，发挥了离子阱高灵敏的优势，能够满足临床诊断的需求。

表3 质控品检测结果Table 3 Quantitative results of QC samples

注：a.25OHD2；b.25OHD3图6 实际血清样品的检测结果Fig.6 Quantitative results of actual serum samples

表4 检测结果相关性分析Table 4 Correlation analysis of quantitative results

图7 实际血清样品的Bland-Altman分析图Fig.7 Bland-Altman analysis results of actual serum samples

3 结论

本研究采用自主研制的QLIT-6610MD液相色谱-串联质谱仪，结合蛋白沉淀和液-液萃取法，建立了准确测量血清25OHD的同位素稀释质谱法。使用QLIT-6610MD、AB 4500MD和YS EXACT 9900MD 3台液质联用仪测定50例实际血清样品，检出25OHD2和25OHD3含量为0.12～71.23 μg/L。采用Pearson系数分析实际血清样本定量数据，3台仪器所测得的数据存在显著的正相关，相关系数R≥0.998 0，并且呈现出P<0.01显著性水平。通过Bland-Altman法分析表明，数据具有良好一致性。这3台仪器所测结果一致，QLIT-6610MD能满足临床诊断需求。

QLIT-6610MD基于四极杆和线形离子阱直接轴向耦联技术，能够大幅减少基质离子干扰，使离子阱更有效地检测目标离子，发挥离子阱高灵敏的离子富集能力。但在同时检测多个目标物质时，由于缺乏MRM、中性丢失等特征离子筛选功能，且离子阱受总离子束的限制，目前仍面临挑战。鉴于离子阱还具有MSn功能、多解离方法以及小型化等特点，该技术还有进一步提升复杂基质中痕量或超痕量目标物测量准确性的强大潜力，未来可用于同时满足高准确性、高灵敏度、现场快速和低成本的质谱监测场景。