COPD患者血清microRNA表达谱及相关生物信息学分析*

胡雪茹 刘军辉 申永春 秦江月 文富强

(四川大学华西医院呼吸与危重症医学科, 四川 成都 610041)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)又称慢阻肺，是一种常见的可预防和治疗的慢性气道疾病，特征是持续存在的气流受限和相应的呼吸系统症状[1]。2021GOLD报道，全球范围到2060年，每年可能有540万以上的人死于慢阻肺和其相关疾病[2]。国内的流行病学研究显示，我国 20岁及以上成人慢阻肺患病率为8.6%，40岁以上的人群将近1亿人，其已成为我国乃至世界范围内的重大慢性非传染性疾病，造成了巨大的公共卫生负担[3]。早期明确慢阻肺的诊断对后续的治疗有重要的临床意义，目前肺功能检查仍是确诊慢阻肺的必备条件，但当前基于肺功能的慢阻肺诊断在我国的临床实践中仍存在较大的挑战[4],寻找到简单易行的慢阻肺诊断标志物具有重要的临床意义。microRNA(miRNA)是一组小的非编码RNA(长度大约为22个核苷酸)，通过mRNA 降解、抑制蛋白质翻译或通过这两种机制的组合，在转录后负调控基因表达，是细胞增殖和分化、发育和凋亡的多个生物途径中的关键调节剂[5]。miRNA已成为包括神经胶质瘤、结直肠癌、肺癌、心力衰竭在内的多种疾病的生物标志物[6]，在疾病的诊断、分期中具备广阔的临床运用前景。近年来研究发现，miRNA与慢阻肺的关系密切，有可能被用作潜在慢阻肺的生物标志物。目前研究发现miRNA可能主要通过调控MAPK、Wnt、NF-κB、JAK-STAT等信号通路参与慢阻肺的发病机制[7]，但其在慢阻肺诊断和致病的详细机制中尚未完全被阐释。因此本研究旨在探索慢阻肺患者血清miRNA差异性表达谱，并通过生物信息学预测差异性miRNA的靶基因并进一步分析其靶基因在调控生物学过程功能分析、信号通路、蛋白质互作中的机制，探索miRNA对慢阻肺的的临床诊断意义及潜在相关的分子生物学机制。

1 资料与方法

1.1 数据的提取及分析 GSE70080的miRNA表达谱数据集从GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载[8], GSE70080位于平台GPL20591中，其中包括16个慢阻肺患者和16个正常血清样本。从GSE70080数据集下载微阵列数据的归一化表达矩阵。然后用数据集中的注释文件对探针进行注释。R软件的“limma”包用于识别差异表达的miRNA。P<0.05基因被认为是差异表达的基因。受试者曲线及火山图、热图聚类图使用R软件的“ggplot2”包进行。受试者工作特征(Receiver operating characteristic, ROC)曲线法评估差异性表达miRNA对慢阻肺的诊断价值。

1.2 靶基因的预测 运用靶基因预测软件TargetScan、PicTar2和 miRanda分别预测差异miRNA的靶基因[9]，再分别取各自在3个软件下预测所得靶基因的交集，然后利用miTarbase数据库获取经过至少3种实验验证并且靶向关系类型为具有功能的miRNA-靶基因相互作的靶基因，将软件预测所得结果与靶向关系预测结果取并集作为所纳入每个miRNA的靶基因集合，绘制miRNA-mRNA网络图。

1.3 靶基因生物信息分析 基因本体(Gene Ontology, GO)分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)信号通路富集分析在R软件中使用“GO plot”包进行。GO分析包括细胞成分(CC)、生物过程(BP)和分子功能(MF)[10]。

1.4 miRNA靶基因的蛋白互作分析 使用STRING数据库(https://string-db.org/)和Cytoscape软件对差异性表达miRNA的靶基因进行蛋白互作网络(Protein protein interaction network, PPI network)分析[11]。

2 结果

2.1 差异性miRNA表达分析 对于慢阻肺组和对照组的高通量测序结果，见图1。根据P<0.05筛选出8个上调和54个下调差异miRNA，与慢阻肺患者相比，miR-655和miR-337在慢阻肺样本中的表达增加了近两倍，miR-645在慢阻肺组织中的表达平均降低了4倍，见图2。

图1 慢阻肺患者与健康对照者血清miRNA差异性表达热图

图2 慢阻肺患者与健康对照者血清miRNA差异性表达火山图

2.2 差异性表达miRNA对慢阻肺的诊断价值 ROC曲线分析显示下调的54个miRNA诊断慢阻肺的ROC曲线下面积为0.969，上调的8个miRNA诊断慢阻肺ROC曲线下面积是0.938，见图3。

图3 差异性表达miRNA诊断慢阻肺的价值

2.3 靶基因的预测与生物富集分析 通过3个靶基因预测软件TargetScan、PicTar2和 miRanda预测靶基因,结合miTarbase数据库中经过验证，共15099个靶基因。GO富集结果见表1，其中下调差异miRNA的靶基因GO富集的主要生物过程涉及Wnt、MAPK、NF-KB信号通路；上调miRNA的靶基因集合生物过程主要涉及Wnt信号通路；在KEGG富集分析中，下调差异miRNA富集于MAPK信号通路；上调差异miRNA富集于Wnt、MAPK信号通路。见图4。

表1 差异性表达miRNA靶基因GO分析结果

图4 差异性表达miRNA靶基因KEGG分析结果

2.4 miRNA与靶基因网络分析 经过实验验证并且靶向关系类型为具有功能的miRNA-mRNA网络图，见图5。其中13种miRNA(hsa-miR-140-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-337-5p、hsa-miR-574-3p 、hsa-miR-645、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-628-3p、hsa-miR-375 和hsa-miR-543)，其中12种下调，1种 miRNA(hsa-miR-337-5p)在上调。4个核心miRNA为：miR-574-3p、hsa-miR-628-3p、hsa-miR-107、hsa-miR-769-5p；多个miRNA与其靶基因相互作用，其中SLC4A8受7个miRNA的调节。

图5 miRNA与靶基因网络分析图

2.5 miRNA靶基因PPI分析 将miRNA的靶基因合并，导入STRING数据库，选择高可信度的互作关系，删除没有互作关系的靶基因点后蛋白互作网络，见图6。根据该网络结构中结点的连通性即按Degree对靶基因进行排序，其中前5位分别是ACVR1B、ACVRL1、KRT2、KRT74、KRT82。

图6 miRNA靶基因编码蛋白质互作网络分析图

3 讨论

慢阻肺的早期诊断与发病机制的探索对其患者的诊治具有重要的临床意义。本研究通过现代生物信息学分析方法研究慢阻肺患者血清样本中的差异性miRNA，寻找潜在的miRNA生物标志物，并通过生物信息分析基于miRNA的慢阻肺发病机制。

慢阻肺差异miRNA的研究在多种样本中得到证实，包括血清、肺组织、痰液、肺泡灌洗液，在临床研究过程中发现异常表达的miRNA与体外研究中的表达趋势一致，并且观察到失调的miRNA与慢阻肺临床严重程度相关，并且会增加稳定的慢阻肺患者急性加重的风险。本次研究发现慢阻肺组和正常对照组血清中miRNA表达存在差异,上调基因有8个，下调基因54个，根据差异miRNA绘制ROC曲线，曲线下面积均大于0.9(P<0.05)，提示miRNA对慢阻肺有一定的诊断价值。其中血清中miR-320表达增加，这与以往研究一致，研究报道miR-320表达增加与生存率正相关，可作为慢阻肺的预后标志物[12]。有研究发现暴露于烟雾主要影响miRNA的下调[13]，在本研究中54个基因表达下调，其中miR-106b被报道可作为反映慢阻肺患者持续或者全身变化的指标[14]。miR-23a、miR-25、miR-145 和 miR-224，与慢阻肺全球倡议 (GOLD) 阶段相关。miR-23a和miR-145在慢阻肺的非频繁和频繁加重者之间有显著差异，miR-23a可能是区分频繁加重和非频繁加重的潜在且有希望的生物标志物[15]。6个差异miRNA(let-7c、miR-125b、miR-324、miR-642、miR-340、miR-532)表达下调，与诱导痰中的表达一致，其中let-7c降低显著。研究发现let-7c的主要靶点是肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNFR-Ⅱ)，且痰中let-7c水平与一秒用力呼气容积(FEV1)呈正相关, 与痰肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNFR-Ⅱ)的蛋白水平呈显著负相关[16],在慢阻肺小鼠模型中进一步证明，TNFR-Ⅱ基因敲除小鼠受到保护，免受香烟烟雾引起的炎症和肺气肿[17]。通过文献学习，本研究发现下调的miRNA-206在肺组织中表达上调，且与重度慢阻肺患者的循环炎症细胞因子有关[18]，如TNF-α、IL-2和IL-5，可通过调节人肺成纤维细胞MRC-5细胞中的IRAK1促进脂多糖诱导炎症损伤[19]，其靶基因Notch3和VEGFA被证明在慢阻肺中可增强诱导细胞凋亡作用[20]。因此miRNA在不同样本之间可能存在表达趋势的差异，还需要进一步探索相关miRNA在慢阻肺中的确切作用。

有研究报道miRNA具有高稳定性、强特异性、高灵敏度和易于在血液中检测，因此可用于临床诊断及预后评估[21]。如miR-3620-3p可以区分慢阻肺和哮喘[22]。Leidinger等[23]表明特定的外周miRNA谱可以区分肺癌和慢阻肺。miR-146a的表达与慢阻肺急性加重期的严重程度呈负相关；miR-218-5p 与严重慢阻肺有相关性，但与吸烟状况无关[24]。miR-146a 和 miR-146b 可以预测慢阻肺患者慢阻肺急性加重期的风险[25]。miR-1273-3p、miR-126、miR-503、miR-34b/c、miR-342-3p、miR-30e-3p、miR-125a-5p与 FEV1% 呈正相关，miR-106b-5p、miR-15b、miR-195、miR-24-3p、miR-320a、miR-320b、miR-34a 和 miR-199a-5p 的水平与 FEV1 %负相关[26]。综上，慢阻肺患者血清中存在显著的miRNA差异性表达，并且对慢阻肺具有一定的诊断及预后价值。鉴于其样本可及性，患者配合程度高，miRNA有望成为慢阻肺的诊断标志物，并且有助于慢阻肺的严重程度评估。

miRNA一般通过其对靶基因的调控发挥其调节作用，本研究对差异性表达miRNA的靶基因进行GO注释和KEGG pathway分析，其结果示差异miRNA的靶基因主要参与NF-kB、Wnt、MAPK信号通路。Wnt 信号通路包含控制各种发育和生理过程的信号分子家族，研究表明，Wnt/β-连环蛋白信号传导参与肺发育、体内平衡、肺上皮损伤和修复过程[27]。慢阻肺的特点是由气道重塑和慢性支气管炎组成的小气道疾病和导致肺气肿的肺实质破坏引起的慢性气流受限。研究显示Wnt/β-catenin 信号在慢阻肺和肺气肿患者及其动物模型中降低，通过Wnt/β-catenin 信号的激活可减少空腔扩大和胶原含量来减轻慢阻肺的症状[28]。典型Wnt/β-连环蛋白激活还可导致肺上皮细胞增殖增加，表明激活Wnt信号传导可引起上皮细胞的修复机制[29]。本研究发现miR-130a上调，与之前研究表达一致，研究发现抑制miR-130a显著减轻香烟诱导的对细胞迁移和增殖的抑制，miR-130a 过表达可阻断香烟刺激引起Wnt 信号的激活，抑制 miR-130a 可通过 Wnt/β-Catenin 信号通路减轻香烟烟雾引起的肺损伤[30]。miR-23a、miR-25、miR-145 和 miR-224也被证明参与了Wnt信号通路[15]。目前研究发现Wnt信号通路以不同方式参与慢阻肺中的慢性气道炎症、气道重塑、肺气肿的发生发展[31]，但仍需要进一步研究以确定miRNA如何调控Wnt信号通路在慢阻肺中的调节机制。

NF-κB作为一种核转录因子, 与免疫应答、炎症反应及细胞的增生、转化、凋亡等病理生理过程密切相关。NF-κB的活化是慢阻肺发病的重要炎症通路之一, 通过调控TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12、COX-2、粘附分子、趋化因子、集落刺激因子等参与了炎症反应各阶段和早期的免疫反应[32]。在啮齿动物中有研究报道miR-30、miR-146、miR-132 和 miR-155参与 NF-κB 通路激活[33]，进一步研究证实在慢阻肺患者的气道或样本中NF-κB通路活性标志物的增加，包括慢阻肺恶化期间的痰巨噬细胞以及在稳定期慢阻肺患者的支气管活检中[34]。如miR-218通过肿瘤坏死因子受体I(TNFR1)介导的NF-κB激活起作用，参与炎症和粘蛋白(MUC5AC)过度产生，而显著下调的 MiR-218被认为是慢阻肺的保护因素[24]。香烟烟雾诱导慢阻肺小鼠气道上皮和肺巨噬细胞中miR-21表达上调，通过miR-21/SATB1/S100A9/ NF-κB轴在慢阻肺中发挥致病作用，遂miR-21可作为慢阻肺的潜在治疗靶点[35]。因此，抑制NF-κB信号通路的活化，可能减少气道细胞中炎症基因的表达，NF-κB抑制剂或调节剂可能具有干预及治疗慢阻肺的潜力。参与NF-κB通路的miRNA可能成为慢阻肺治疗新靶点。

本文通过miRNA靶基因的预测，进一步构建了潜在的miRNA-mRNA调控网络。其中4个miRNA(miR-574-3p、hsa-miR-628-3p、hsa-miR-107、hsa-miR-769-5p)为核心基因。之前研究报道miR-628-3p在慢阻肺和有无吸烟患者中表达下调，miR-574-5p在香烟烟雾(0.5%)处理3天的人支气管上皮细胞，较对照组表达下调[36]，这均与本研究结果一致，提示吸烟可能影响慢阻肺患者miRNA的表达。miR-107、miR-769-5p的失调与各种肿瘤发展有关，尚未有研究探索miR-107、miR-769-5p与慢阻肺之间的关系。本研究中SLC4A8受7种miRNA调控，可能成为慢阻肺的核心基因。预测SLC4A8存在多个miRNA结合位点，后续的的研究需进一步探索其在慢阻肺中的作用机制。通过PPI分析，ACVR1B、ACVRL1、KRT2、KRT74、KRT82、NR4A1可能是参与慢性阻塞性肺疾病发生发展的核心基因。其中ACVR1B是TGF-β配体家族的成员，可控制许多细胞过程，研究显示其表达水平与肺气肿的分布具有显著关联[37]。ACVRL1是一种参与血管生成的内皮转化生长因子β受体[38]，在肺动脉高压中发现ACVRL1突变，会导致 TGF-β/(BMP)信号受损，改变的BMP受体信号影响炎症及其消退、DNA损伤及其修复以及细胞代谢的调节[39]。NR4A1参与FSTL-1(卵泡抑素样1)缺陷型肺气肿的形成[40]，也可通过NF-κB信号传导，进而以负反馈方式下调炎症因子，减轻气道炎症[41]。KRT2、KRT74、KRT82编码不同角蛋白，其与角质形成细胞活化、增殖和角质化相关，但目前在慢阻肺中的报道有限，还需要进一步研究。综上所述，绕着这些基因深入研究，有望进一步阐明慢阻肺的发病机制，为慢阻肺的干预寻找到新的靶点。

研究已发现miRNA促进肺部发育、成熟，且在维持肺功能中发挥重要作用[42]。miRNA可从多个层面、多个机制参与慢阻肺的发病机制。慢阻肺一个重要发病机制是由慢性炎症引起的支气管上皮细胞的凋亡和增殖变化。多种miRNA被发现参与气道炎症，如miR-24-3p, miR-93-5p, miR-320a/b, miR-1273-3p，其靶基因主要是促炎基因，富集于NOD样受体 ( NLR ) 和 Toll样受体(TLR)通路[43]。此外还有miR-233被证实可控制肺细胞中HDAC2的表达和活性，从而调节慢阻肺的肺部炎症[44]。Izzotti等[45]的研究分析了暴露于香烟烟雾环境的大鼠肺中126个 miRNAs下调，其主要调节应激反应、细胞凋亡、增殖、血管生成和基因表达，提示miRNA可能与慢阻肺的损伤与修复有关。Conickx等[24]的研究发现miR-218-5p的表达与气道阻塞密切相关，在没有气流受限的吸烟者的肺中，miR-218-5p在戒烟至少1年后表现出正常的表达水平，无论是否吸烟，慢阻肺患者 miR-218-5p的不可逆下调可能导致持续的全身和肺部炎症。miR-195在慢阻肺患者中表达增加，进一步研究发现抑制miR-195 可减轻吸烟诱导的肺损伤并阻断体内炎症过程，可能为慢阻肺的治疗提供新靶点[46]。

免疫失调是慢阻肺的另一个重要发病机制。Shi等[47]证明miR-203通过靶基因TAK1和 PIK3CA发挥免疫反应抑制剂的作用，miR-203可能通过抑制吸烟者的免疫反应，促进慢阻肺的发生发展。据报道，慢阻肺患者的调节性T细胞中的 miRNA表达谱显著改变。其中miR-199a-5p对调节性T细胞具有特异性，miR-199a-5p可通过影响Th1-Th17 平衡从而导致慢阻肺的发生[48]。自噬和细胞凋亡也在慢性阻塞性中发挥重要作用。在人支气管上皮细胞中miR-21参与香烟烟雾诱导的自噬和细胞凋亡[49]。过表达miR-34a可显著增加人肺微血管内皮细胞的凋亡率。Notch1的过表达对由miR-34a升高引起的人肺微血管内皮细胞凋亡具有保护作用[50]。差异表达的miRNA对慢阻肺也有保护作用。如miRNA-212-5p在体外细胞通过促进细胞增殖和抑制香烟烟雾诱导的慢阻肺相关基因和蛋白质的表达对慢阻肺发挥保护作用[51]。miR-483通过促进细胞生长和激活α-SMA和纤连蛋白发挥保护作用[52]。以上研究表明，miRNA从多个方面参与了慢阻肺的发病机制，未来需更多的研究明确与发病机制相关的miRNA和其关键通路，为慢阻肺探索新生物标志物。

4 结论

本研究结果发现慢阻肺患者血清中存在差异miRNA，其对于慢阻肺的诊断有一定帮助。经过靶基因的预测及和相关通路分析，提示miRNA与慢阻肺发病机制密切相关，也为后续的研究提供了生物信息学的基础。