热水处理减轻黄瓜果实低温冷害的贮前延迟条件优化

贾 淼，张 敏，2，3*，李奇勋，郑 凯，方佳琪，李玉申，王红婷

（1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.食品科学与工程国家级实验教学示范中心(上海海洋大学)，上海 201306；3.上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台，上海 201306）

【研究意义】采后黄瓜（Cucumis sativusL.）在流通和储藏过程中容易衰老黄化、失水萎蔫，甚至腐烂变质[1]。在适宜低温条件下贮藏时会降低其机体代谢活性，从而延缓果实衰老。然而在低于7 ℃临界温度下流通贮藏时，黄瓜果实内部组织会出现结构性损伤，转移至室温时便会有可见性冷害症状[2-3]，进而导致黄瓜耐贮性下降，食用价值受损。因此，如何有效减轻黄瓜冷害并保持其品质优良，是黄瓜冷链流通储藏中关键的待解决问题。热水处理作为一种简单、安全高效的贮前处理方法已被广泛用于减轻果蔬冷害的研究中[4-8]，适宜的热水处理能够有效延缓冷害症状的出现。现阶段果蔬贮藏保鲜领域方面大多集中在探究适宜的热水处理条件以减轻果蔬冷害，并已取得了显著的成果。【前人研究进展】然而在实际操作中，贮前热水处理后的延迟放置条件对果实机体抗氧化活性和品质变化是不可忽略的因素，对果蔬的经济效益也会产生一定影响。Hu 等[9]研究了热水处理后黄瓜于室温（25±1）℃下延迟放置不同时间对低温贮藏期间果实抗氧化酶活性和品质的影响，发现延迟放置2 h 可以显著降低果实冷害程度，同时相关抗氧化酶活性也得以提高，这表明热处理后适宜延迟放置对提高黄瓜果实贮藏品质有良好效果。番木瓜经热水处理（42 ℃、30 min和49 ℃、20 min）后，于室温（25±2）℃下放置20 min时，其果皮和果肉的冷害发生率均被有效降低，同时贮藏期也得以延长[10]。同样地，桃果实[11]经热水处理后置于室温下1 h，可显著缓解果实冷害症状和褐变程度，同时提高果实机体中抗氧化物质含量及贮藏品质。Endo 等[12]将青梅果实热水处理（45 ℃、5 min）后用20 ℃流动水冷却，发现能够有效提高青梅果实的耐冷性，缓解果实冷害，并将其贮藏时间延长至原来的3倍。【本研究切入点】然而上述试验都是基于单一延迟条件来探究对果蔬冷藏效果的影响，关于热处理后空气降温和冷水降温的对比研究仍较少见，并且对于提高热处理后果蔬抗冷性的贮前延迟放置条件的优化研究还鲜有报道。为此，对热水处理后黄瓜果实在不同介质（空气、冷水）中的延迟放置条件展开了优化及对比研究。由于果蔬发生冷害症状时细胞膜会出现龟裂和孔道，导致膜内离子外渗，进而表现为电解质外渗率升高，电解质外渗率常被用作细胞膜通透性和膜脂过氧化程度的响应指标，它能够更直接、更灵敏地反映出果实遭受冷害的严重程度[13]。因此，试验以电解质外渗率为响应值来表征冷害现象，同时在单因素试验中选择失重率作为电解质外渗率的验证指标，以增加试验精确性和可靠性。二次正交旋转组合设计被广泛用于优化分析多因素试验，该优化方法试验次数少、计算简便，能够高效准确地确定试验最佳条件[14]，现今已有多位学者采用该法进行工艺或技术参数的优化[15-17]。【拟解决的关键问题】本文将二次正交旋转组合设计与响应面法[18-22]相结合以期优化得出热水处理后黄瓜置于低温贮藏前的最佳延迟条件，旨在为黄瓜热处理技术的进一步完善和冷害的防治提供一定的实验参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料’申青’黄瓜采自上海市浦东新区临港当地种植园，采摘后装于泡沫箱中在3 h 内运送至实验室。将所有黄瓜进行分类，挑选出平均长度为（23±2）cm，平均直径为（3.5±0.5）cm，单根果实的质量为（200±20）g，无病虫害，无机械损伤的黄瓜。为避免黄瓜果实机体温度差异造成的试验误差，将黄瓜置于（20±1）℃环境中复温2 h 以统一果体温度。

1.2 热处理及试验设计

将复温后的黄瓜果实随机分为2 组，称重后进行40 ℃、20 min 的热水处理（hot water treatment，HWT）（该条件为前期试验研究得出），之后进行水浴延迟静置和空气延迟静置单因素及二次正交旋转组合试验设计。1）HWT 后水浴静置组：共处理180 根黄瓜果实，其中温度单因素试验是将HWT 后的黄瓜果实置于5，10，15，20，25，30，35 ℃水中静置60 min；时间单因素试验是将HWT 后的黄瓜果实置于20 ℃水中静置0，40，50，60，70，80，90 min。2）HWT 后空气静置组：共处理192 根黄瓜果实，其中温度单因素是将HWT 后的黄瓜果实拭干表面水分，立即转移至5，10，15，20，25，30，35 ℃的恒温恒湿箱中静置1.5 h；时间单因素试验是将HWT 后的黄瓜转移至20 ℃的恒温恒湿箱中静置0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h。并在以上单因素试验的基础上，分别进行二次正交旋转组合试验。所有处理结束后，拭干黄瓜果实表面的水分，将全部黄瓜果实装入带有小孔的聚乙烯薄膜袋（厚度0.02 mm）中，每袋装入3 根黄瓜，立即转移至冷库[（4±1）℃，相对湿度：80±5%]中，于贮藏6 d 后进行指标测定，每个指标重复测定3 次，结果取其平均值。

1.3 仪器与设备

恒温恒湿培养箱（BPS-100CA，上海一恒科学仪器有限公司），电热恒温水温箱（HSWX-600BS，上海圣科仪器设备有限公司），数字孔式电子天平（BJ2100D，台湾精达电子仪器有限公司），电导率仪（DDS-307，上海笛柏实验设备有限公司），恒温振荡箱（HZ-82A，江苏省金坛市环宇科学仪器厂）

1.4 试验方法

1.4.1 电解质外渗率的测定 电解质外渗率的测定参考盖晓阳等[23]的方法稍作修改。用切片器将黄瓜果实中部切成厚度均匀（约为0.07 mm）的薄片，再用打孔器从薄片果肉区域取10 片直径相同的小圆片置于筛网上，去离子水冲洗小圆片3 次后用滤纸轻拭表面水分，置于50 mL 的烧杯中，准确加入20 mL、0.25 mol/L 的甘露醇溶液，测定溶液电解质外渗率，记录为R0。用保鲜膜封口后置于恒温振荡箱中振荡1.5 h，结束后测定溶液的电解质外渗率记录为R1。测量后，将烧杯口用保鲜膜和橡皮筋紧封，置于100 ℃沸水中蒸20 min，待烧杯中溶液冷却后再次测量电解质外渗率并记录为R2。以上电解质外渗率的测定均在同一温度下进行。根据公式（1）计算电解质外渗率，以Y代表电解质外渗率。

1.4.2 失重率的测定 失重率采用称重法测定，每个试验组取6 根黄瓜用于重量测定，先用电子天平称重新鲜黄瓜，并记为初始重量m0，相同黄瓜低温贮藏6 d后再次称重，记为m。根据公式（2）计算失重率。

1.4.3 冷害指数的测定 冷害指数的测定参照Martınez-Tellez 等[24]的方法。低温贮藏后的黄瓜果实在室温条件下（20±2）℃放置2 d 后，通过观察果实表面点蚀和凹陷区域面积评定冷害等级（表1）。根据公式（3）计算冷害指数。

表1 冷害等级的划分Tab.1 Classification of chilling injury grades

1.5 数据处理

用SPSS 23.0 软件进行方差分析及Duncan 多重比较，显著性水平设为0.05。利用SAS 9.4 软件进行响应面设计及分析。采用Origin 2021软件绘制图表，图表结果均为平均值±标准差，并标注显著性差异。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 延迟静置温度对低温贮藏黄瓜果实的影响 电解质外渗率是衡量果蔬细胞膜脂过氧化程度的重要指标，能判断出果实遭受冷害的严重程度。如图1（A）所示，黄瓜果实电解质外渗率随水浴静置温度的上升呈现先下降后升高的趋势，其中5 ℃水浴静置组的电解质外渗率最高，35 ℃组次之，20 ℃组最低，为6.52%。与20 ℃水浴静置组相比，5 ℃和35 ℃水浴静置组的电解质外渗率增幅最多，达到92.63%和71.1%。失重率作为评判果蔬品质优劣的重要指标，其变化与果蔬机体的呼吸作用和蒸腾速率密切相关[25]。如图1（B）所示，黄瓜果实的失重率变化同样呈现出先降低后升高的趋势，其中，20 ℃延迟处理能够显著降低黄瓜果实质量损失（P＜0.05），而经35 ℃水浴延迟处理后的果实呼吸速率加快，水分损失较多。因此，选择10～30 ℃作为水浴延迟静置温度编码范围来进行后续响应面试验。

图1 HWT后不同水浴静置温度对低温贮藏黄瓜果实电解质外渗率（A）、失重率（B）的影响Fig.1 Effects of water bath temperature after HWT on electrolyte leakage rate（A）and weight loss rate（B）of cucumber fruits during low temperature storage

如图2（A）所示，空气延迟静置各试验组的电解质外渗率值随静置温度的升高差异显著（P＜0.05），表现出先缓慢降低再迅速升高的趋势，其中，20 ℃空气静置组的电解质外渗率达到最低值，仅为4.14%。当空气静置温度高于20 ℃时，黄瓜果实受到的低温损伤快速加剧，尤其是35 ℃空气静置组，是最低值的5.50 倍。此时黄瓜果实细胞膜完整性被破坏，进而导致果实冷害加重。图2（B）中失重率的变化与上述电解质外渗率的趋势一致。其中，15 ℃空气静置组的失重率最低，仅为1.28%，当空气静置温度超过15 ℃时黄瓜果实的质量损失开始显著快速增加（P＜0.05）。与指标最低值相比，35 ℃空气静置组的失重率增加了126.56%。因此，选择5～30 ℃作为空气静置温度编码范围用于条件优化。

图2 HWT后不同空气静置温度对低温贮藏黄瓜果实电解质外渗率（A）和失重率（B）的影响Fig.2 Effects of air standing temperature after HWT on electrolyte leakage rate（A）and weight loss rate（B）of cucumber fruits during low temperature storage

2.1.2 延迟静置时间对低温贮藏黄瓜果实的影响 果实热处理后积累的热应力会因暴露时间长短而异[26]，并且热激效应的持久程度对于黄瓜在低温贮藏期间的冷害缓解和品质保持至关重要。如图3（A）所示，水浴延迟静置试验组黄瓜果实电解质外渗率表现出先缓慢下降再迅速升高的趋势，其中，70 min水浴静置组黄瓜的电解质外渗率最低。当水浴静置时间由80 min 增加到90 min 时，电解质外渗率大幅提升了167.56%。可见，黄瓜经90 min 延迟放置时，其细胞膜通透性和膜脂过氧化程度都会加剧。与上述电解质外渗率的变化趋势类似，由图3B 可知，失重率也表现为先下降后上升，0 min 处理组失重率最高，其次是90 min 处理组时，果实失重率达到最低值的2.92 倍，表明果实水分流失较多对组织结构造成了影响。综合以上，选择40～80 min 作为水浴延迟静置时间编码范围来进行后续响应面试验。

图3 HWT后不同水浴静置时间对低温贮藏黄瓜果实电解质外渗率（A）和失重率（B）的影响Fig.3 Effects of water bath time after HWT on electrolyte leakage rate（A）and weight loss rate（B）of cucumber fruits during low temperature storage

如图4（A）所示，各空气静置组黄瓜果实的电解质外渗率随静置时间大体上表现为先下降后升高的趋势，仅3.5 h试验组处有轻微浮动。试验组中4 h空气静置组电解质外渗率值最高，0 h组次之，1.5 h组电解质外渗率值最低，说明热处理后于20 ℃空气中延迟静置1.5 h对于减轻黄瓜果实组织内部离子渗漏和保持黄瓜果实热激效应有良好效果。并且0 h 和0.5 h 试验以及3 h 和3.5 h 试验组之间并无显著性差异（P＜0.05）。如图4（B）所示，失重率与上述电解质外渗率值的变化趋势一致，并且热处理后黄瓜果实于20 ℃空气中静置4 h 时，失重率大幅上涨，说明这一条件并不适宜其自身生长调节。因此，选择0.5～3 h作为空气延迟静置时间编码范围进行优化。

图4 HWT后不同空气静置时间对低温贮藏黄瓜果实电解质外渗率（A）和失重率（B）的影响Fig.4 Effects of air standing time after HWT on electrolyte leakage rate（A）and weight loss rate（B）of cucumber fruits during low temperature storage

2.2 响应面优化试验

2.2.1 试验设计与结果 根据单因素试验结果即水浴静置条件为10～30 ℃、40～80 min，空气静置条件为5～30 ℃、0.5～3 h，设置如表2所示因素水平编码表，并设计进行二次正交旋转组合试验，结果见表3，其中Y1、Y2分别代表水浴静置组和空气静置组的电解质外渗率响应值。

表2 因素水平编码表Tab.2 Code table for the factor and level

表3 二次正交旋转组合设计试验结果Tab.3 Quadratic regression orthogonal rotating combination design and experimental results

2.2.2 模型的建立及显著性检验 利用SAS 9.4软件处理分析试验数据后，得到回归方程模型和各项的方差分析、参数估计及显著性检验，其结果见表4和表5。

对试验数据进行拟合处理后得到关于电解质外渗率的目标函数的二次回归方程，结果见式（4）、式（5）：

由以上2 个回归模型的方差分析（表4）可知，对回归模型Y1进行显著性分析F1=30.85＞F0.01（5，10）=5.64，结果极显著（P＜0.001），且决定系数R2=0.939 1，表明回归模型Y1与实测值的吻合度较高，模型成立。对回归方程进行失拟性检验，可知F2=MS失拟/MS误差=2.53＜F0.05（3，7）=4.35，即不显著，说明回归方程拟合充分，无失拟因素存在。综上，此模型拟合度良好，试验误差小，合理可行。

表4 回归模型的方差分析Tab.4 Variance analysis of regression model

由表5可知，在σ=0.10显著水平上剔除不显著项，能够得到以下回归方程式：

表5 试验二次回归模型参数Tab.5 Regression model parameters

由表4和表5得知，回归模型Y2中F1=105.53＞F0.01（5，10）=5.64，结果极显著（P＜0.001），且R2=0.981 4，表明回归模型与测试值能较好拟合，模型成立。对回归模型进行失拟项检验：F2=2.86＜F0.05（3，7）=4.35，即不显著（P＞0.05），说明该回归方程不存在失拟因素。因此，该模型可用于对黄瓜果实HWT 后空气延迟条件进行分析和预测。

2.2.3 响应面优化与分析 根据回归方程分别绘制水浴静置条件和空气静置条件对热处理后冷藏6 d黄瓜果实电解质外渗率Y影响的等高线图和响应面曲线图，结果见图5和图6。

图5 电解质外渗率的等高线图（A）和响应面曲线图（B）Fig.5 Contour plots（A）and response surface plots（B）of electrolyte leakage rate

如图5所示，随着水浴静置温度和时间的延长，电解质外渗率值会先降低后增加，且根据响应面曲线图弯曲程度可以看出与水浴静置时间相比，静置温度对电解质外渗率值影响更大。根据图5A 显示等高线中心呈圆形，说明水浴静置温度和水浴静置时间之间的交互作用偏弱，即影响不显著，这与表4中显著性检验的结果相一致。当水浴静置温度低于16.67 ℃时，曲面较陡峭，表明较低温度对果实电解质外渗率的影响较强，这可能与热处理和延迟条件之间的温度差异较高有关。在水浴静置温度10～30 ℃，水浴静置时间40～80 min 条件下优化得出热水处理后黄瓜果实于20.8 ℃水中放置54.07 min 时，电解质外渗率存在最小值，此时理论最小值为11.26%。

图6 为空气中延迟静置对电解质外渗率影响的等高线图和响应面曲线图。如图6A 所示，等高线中心为椭圆形，说明空气静置温度和静置时间之间有极显著的交互作用。由图6B 可知，随着延迟放置时间的增加，电解质外渗率呈现明显的先下降后上升的趋势；而且黄瓜经短时较高温延迟静置时，电解质外渗率值出现急剧增加的变化，此时热激效应持续时间较短，待立即转移至低温贮藏时，该热激效应会被阻断，进而造成更严重的氧化损伤。经响应面优化后得出空气延迟条件为16.92 ℃，1.98 h，此时电解质外渗率存在最小值，即9.3%。

图6 电解质外渗率的等高线图（A）和响应面曲线图（B）Fig.6 Contour plots（A）and response surface plots（B）of electrolyte leakage rate

2.2.4 响应面试验模型验证分析 取60 根黄瓜果实对上述优化得出的最佳延迟条件进行试验验证，于低温贮藏6 d后测得水浴延迟优化条件下，黄瓜果实电解质外渗率值为12.01%，与理论值相差0.75%；空气延迟条件下黄瓜果实的电解质外渗率实测值则为10.14%，与理论值相差0.84%，说明以上回归模型的拟合度较好，均有较高的可信度。与未延迟组相比，优化试验中黄瓜果实的电解质外渗率值也相应降低了6.63%和8.50%，较未热处理组的电解质外渗率（实测值28.73%）相比，降低了16.72%和18.59%。同时黄瓜果实的冷害症状可由表6 直观反映得知，各验证试验组与对照组冷害指数差异显著（P＜0.05），即果实表面出现了不同程度的可见性冷害，其中D 组直接低温贮藏时冷害指数最高，表明果实遭受冷害程度较严重。相比之下，A、B 延迟试验组处理后冷害指数显著低于对照组D 的64.29%、78.57%（P＜0.05），果实仅表现出微乎其微的冷害症状。

表6 4 ℃贮藏6 d后室温下2 d时黄瓜果实的冷害指数Tab.6 Chilling injury index of cucumber fruits after 6 days at 4 ℃ and 2 days at ambient temperature

该验证结果表明，热水处理后适当的水浴和空气延迟放置均能有效缓解黄瓜果实冷害，其中B 组空气延迟优化条件处理效果更佳，可以更有效地抑制黄瓜果实膜脂过氧化，减少离子渗漏，进一步维持黄瓜果实的良好贮藏品质。

3 讨论与结论

适宜的冷热处理对于缓解果蔬机体冷害症状、增强其抗逆性有良好效果[11,27-29]。冷害防治程度则取决于处理方式的温度、持续时间以及温差，同时与果蔬品种和生长环境也有密切关系[30]。该试验在黄瓜果实经有效热水处理的基础上，进一步探究优化了能显著减轻果实低温贮藏冷害症状的最佳延迟条件。延迟条件以水和空气为介质，经单因素试验和响应面试验优化后，分别得出了各自的最佳延迟参数，水浴延迟条件优化结果为水浴静置温度20.8 ℃，水浴静置时间54.07 min，在此条件下，黄瓜果实低温贮藏后的电解质外渗率理论值为11.26%；空气延迟条件优化结果为空气静置温度16.92 ℃，空气静置时间1.98 h，基于此条件，黄瓜果实的电解质外渗率理论值为9.3%。经试验验证得知，水浴延迟条件下电解质外渗率实测值为12.01%，空气延迟条件实测值为10.14%，均与理论值较为接近，说明各模型的理论值与实测值能较好吻合，模型准确可靠。可见，热处理后不同的延迟介质对优化结果以及果实细胞膜透性均有不同程度的影响，并且空气延迟条件比水浴延迟条件更能有效降低电解质外渗率和保持果实细胞膜完整性，这可能是由于介质传热速率和处理时间的差异导致黄瓜果实内部温度变化不一致，进而影响热处理和果实抗冷性的诱导效果[31]。

试验中两组延迟条件均能使果实维持正常的细胞膜组织结构并有效缓解其冷害。与该研究结果一致，Wang 等[32]发现香蕉果实热水处理（52 ℃，3 min）后在20 ℃环境中延迟放置1.5～6 h 时，果实中抗坏血酸过氧化物酶的活性和基因表达均有所增强，并且延迟3 h后果实低温贮藏期间的抗坏血酸基因表达仍保持较高水平，表明热处理适当延迟后果实的抗冷性被增强。这可能是由于热处理后适当延迟有助于果蔬机体从热处理中恢复，并且使果实逐步适应低温的生理代谢过程，进一步启动果实自身的抗冷性，进而减轻长时间低温贮藏对果实造成的伤害。适当延迟处理可以提高果蔬抗冷性，与相关基因的高活性表达有密切关系。Bowen 等[26]研究发现苹果经38 ℃热水处理1 h 后，置于25 ℃环境中恢复1.5 h，热激蛋白（heat shock proteins，HSPs）基因的转录维持在较高水平，这可能是果实热处理后耐热性和热激效应得以保持的原因。同样地，在对鳄梨[33]的研究中也发现热水处理后于15 ℃环境中延迟3 h，HSP70 基因的转录水平达到峰值。该试验优化得出的水浴延迟条件和空气延迟条件均能够有效将低温胁迫下的黄瓜果实电解质外渗率维持在较低水平，减轻果实冷害，可能是由于热处理诱导相关抗氧化酶基因和热激蛋白基因的高活性表达，并在延迟条件下继续诱导以维持已产生的持续热效应，同时伴随增加的还有抗氧化物质和超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等活性氧清除酶，多方协同作用能够使果实保持细胞膜结构完整性，进而减轻黄瓜果实冷害和增强果实抗冷性。

综上所述，试验中经响应面优化得出的贮前水浴和空气延迟条件均能有效降低膜内电解质外渗，更有利于维持原有热激作用并提高黄瓜果实抗冷性，能够进一步加强热水处理减轻果实冷害的防治效果。在实践应用上水浴延迟耗时更短，相对来说温度更易控制，并且时间和人力的成本更低；空气延迟处理虽耗时较长，但处理效果相对来说更优。因此，商业中可根据实际情况来选择相应的处理条件，以延长果蔬贮藏期，提高贮藏品质和果农收益。同时，该研究结果为防治黄瓜果实低温胁迫下冷害发生提供了一定的试验参考与理论支持。