鲜铁皮石斛对肺腺癌A549细胞的作用及其可能机制▲

林岳岩 张秀玲 韦 明 黄 敏 张沥仁 朱莉莉 覃议贤 张锡流

(广西中医药大学附属第一医院病理科，广西南宁市 530023)

2020年，肺癌的病死例数位居全球癌症的首位，新发病例数位居第二[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)为肺癌的主要类型。传统医疗手段治疗NSCLC的效果并不显著，其中ⅠB期患者的5年生存率仅为68%，而ⅣA期、ⅣB期患者的生存率不足10%[2]。虽然免疫检查点抑制剂对NSCLC具有较好的疗效，但是有研究表明，免疫治疗仅能为20%～30%的患者提供长久的疗效[3]。因此，积极探寻新的治疗方案迫在眉睫。铁皮石斛是传统医学中常用的名贵中草药，有滋阴强肾、补中泄热等功效。现已有诸多临床试验证实，铁皮石斛具有降低白细胞介素2、肿瘤坏死因子α等细胞因子水平[4]，抑制肿瘤细胞增殖[5-6]，诱导肿瘤细胞凋亡[7-8]等作用，而铁皮石斛治疗肿瘤的主要有效成分为柚皮素、毛兰素、石斛酚等[9]，但目前铁皮石斛在肺癌领域中的研究较为少见。肺腺癌属于NSCLC，故本实验以肺腺癌A549细胞为研究对象，探究鲜铁皮石斛制剂对肺腺癌A549细胞增殖和迁移能力的影响及其可能作用机制，旨在为临床治疗NSCLC提供新的思路和方案。

1 材料与方法

1.1 试剂 鲜铁皮石斛产自云南文山壮族苗族自治州，由广西中医药大学第一附属医院制剂中心制备成浓度为0.4 g/mL的鲜铁皮石斛制剂[通过旋转蒸发仪浓缩，0.22 μm 聚醚砜滤过膜(Millipore公司)过滤]。基础培养基DMEM(Gibco公司，批号：C11995500BT)，PBS、双抗溶液、胰酶、Hoechst 33258 染色液(Solarbio公司，批号：P1020、P1400、T1300、C0021)，ExCell南美胎牛血清[依科赛生物科技(太仓)有限公司，批号：FSP500],CCK-8 试剂盒(日本同仁化学研究所，批号：CK04)。

1.2 实验仪器 CKX41SF型倒置荧光显微镜(Olympus公司)，DMI3000B型倒置荧光显微镜(Leica公司)，DMi8型倒置荧光显微镜(Leica公司)，Multiskan Sky型触屏版全波长酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司)，D-37520型离心机(Thermo Fisher Scientific公司)，MCO-18AIC 型CO2细胞培养箱 (日本普和希株式会社)，HR1200-ⅡB2型生物安全柜(中国海尔公司)。

1.3 细胞培养 人非小细胞肺癌A549细胞来源于中国科学院昆明细胞库。采用含90%DMEM、10%胎牛血清、1%双抗配置的完全培养基培养细胞，设置培养箱的条件为37 ℃、5% CO2、饱和湿度；待细胞融合度达70%～80%时传代，适当控制传代细胞数，3～4 d传代一次，传代前先用PBS清洗培养瓶3次，然后用1.2 mL胰酶消化细胞2～2.5 min，并轻拍细胞瓶侧壁以震动未脱落细胞，800～1 000 r/min离心3～5 min，使用完全培养基重悬细胞后，继续传代培养。

1.4 CCK-8法测定细胞活性 将培养瓶中生长良好形态健康且融合度达70%～80%的细胞收集至15 mL的离心管中，1 000 r/min离心5 min后以完全培养基重悬细胞，以每孔2.5×103个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入200 μL 完全培养基，放置于培养箱中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度下培养24 h。待细胞完全贴壁后，吸出剩余培养基，分别加入浓度为0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL的鲜铁皮石斛(分别设为0.5 mg/mL组、1.0 mg/mL组、1.5 mg/mL组、2.0 mg/mL组)与完全培养基混合液(分别加入15 μL、10 μL、5 μL、0 μL超纯水及180 μL培养基以控制药物浓度，使任意指定浓度药剂混合液中完全培养基浓度不变)，每个浓度设置5个复孔。于培养箱中在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的条件下分别培养24 h、48 h后，拿出96孔培养板，将培养板倾斜一定角度后吸出药剂及完全培养基混合液以减少制剂对CCK-8试剂的影响，减小检测所产生的误差，加入10%的CCK-8与90%的DMEM各100 μL，将干预24 h的细胞与干预48 h的细胞分别避光孵育80 min、60 min后，置于酶标仪检测 450 nm 处的吸光度值，计算细胞抑制率，细胞抑制率 = [(对照孔吸光度值 — 实验孔吸光度值) / (对照孔吸光度值 — 空白孔吸光度值)] × 100%，并计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。其中空白孔仅加入培养液，对照孔加入培养液与细胞，实验孔的细胞为各浓度鲜铁皮石斛干预组细胞。实验重复3次。

1.5 细胞划痕实验 将细胞分为空白组和鲜铁皮石斛组进行实验。因高浓度组细胞死亡过多，无法继续观察划痕实验结果，故本实验步骤仅采用IC50作为鲜铁皮石斛组的干预浓度。收集培养瓶中生长良好形态健康且融合度达70%～80%的A549细胞至15 mL离心管，以1 000 r/min离心5 min后采用完全培养基重悬细胞，将细胞以每孔约3×105个的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全培养液，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。待6～8 h后观察细胞已完全贴壁，用 200 μL枪头垂直于孔板沿中线划痕，划痕动作适度，划痕后沿孔壁缓慢加入PBS清洗3次以去除划下的细胞。随后在鲜铁皮石斛组细胞中加入2 mL浓度为IC50的鲜铁皮石斛制剂，空白组加入等体积完全培养液，干预后将细胞放置于培养箱中继续培养0 h、12 h、24 h 后，在DMi8型倒置荧光显微镜下，每孔选取3个视野(20倍镜)拍照，用Image J软件测量划痕面积，根据所得面积，通过计算愈合率以评价细胞迁移能力(愈合率越大，细胞迁移能力越低)，愈合率=1-(某时间点划痕面积/0h划痕面积)×100%。实验重复3次。

1.6 免疫荧光实验 将生长良好形态健康且融合度达70%～80%的A549细胞收集于15 mL离心管中，以1 000 r/min离心5 min后采用完全培养基重悬细胞，将细胞以每孔3.0×106个接种于 6 孔板中，每孔加入2 mL完全培养基，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养 24 h。 将细胞分为低浓度组、中浓度组、高浓度组和空白组，其中低剂量组、中剂量组、高剂量组细胞按0.5倍IC50、1.0倍IC50、2.0倍IC50加入鲜铁皮石斛制剂2 mL，空白组不做干预。干预24 h后弃培养基，使用PBS将Hoechst 33258荧光染色液进行100倍稀释后将其加入细胞中，1 mL/孔，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中继续孵育25 min后，取出细胞，用PBS清洗2次后，置于DMI3000B型倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察，拍照并记录。Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，Hoechst 33258能少许进入正常细胞膜，使其发出蓝色荧光，而凋亡细胞的膜通透性增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33258 比正常细胞的多，荧光强度比正常细胞高，因此凋亡细胞数越多，释放的蓝紫色荧光信号越强。实验重复3次。

1.7 统计学分析 采用 SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较釆用SNK-q检验，组内比较釆用配对t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度鲜铁皮石斛对肺腺癌A549细胞增殖的影响 干预24 h后，1.5 mg/mL组、2.0 mg/mL组A549细胞的增殖抑制率高于0.5 mg/mL组(P<0.05)，但1.0 mg/mL组与0.5 mg/mL组A549 细胞的增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05)；1.0 mg/mL组、1.5 mg/mL组、2.0 mg/mL组A549细胞的增殖抑制率依次升高(均P<0.05)。干预48 h后，0.5 mg/mL组、1.0 mg/mL组、1.5 mg/mL组、2.0 mg/mL组A549细胞的增殖抑制率依次升高(均P<0.05)。除0.5 mg/mL组外，其余浓度组干预48 h后A549细胞的增殖抑制率均高于干预24 h后(均P< 0.05)。见表1。因考虑到该实验培养环境下，干预48 h的细胞其培养液损耗、细胞健康情况下降等不定因素影响增多，故取鲜铁皮石斛干预24 h的IC50为本实验的IC50，经计算，鲜铁皮石斛干预24 h的IC50约为2.0 mg/mL。

表1 不同浓度鲜铁皮石斛作用后A549细胞的增殖抑制率(x±s,%)

2.2 鲜铁皮石斛对A549细胞迁移力的影响 干预12 h、24 h后鲜铁皮石斛组细胞的愈合率均高于空白组(均P<0.05)，即细胞迁移率降低。见表2、图1。

表2 两组A549细胞的划痕愈合率比较(x±s,%)

图1 鲜铁皮石斛作用后 A549 细胞的迁移情况(倒置显微镜，×20)

2.3 不同浓度鲜铁皮石斛对A549细胞凋亡形态学的影响 空白组的肺腺癌A549细胞荧光略显微弱，细胞核分布均匀，大体呈淡蓝色染色，偶见亮蓝色染色的凋亡细胞；与空白组比较，低、中、高组细胞在荧光显微镜下出现强荧光反应，部分细胞呈不规则形态，细胞出现较为明显的凋亡形态学特征，且细胞核呈亮蓝色染色的细胞数量随浓度增加呈现增长趋势。见图 2。

图2 不同浓度鲜铁皮石斛作用后A549细胞的凋亡情况(荧光倒置显微镜，×200)

3 讨 论

在细胞癌变过程中，维持细胞正常生长、增殖、凋亡等的诸多基因及蛋白的表达出现失衡，导致肿瘤细胞恶性增殖等情况，这一过程涉及多种致癌基因的激活、抑癌基因的失活和基因突变。如何调控肿瘤细胞增殖，一直是现代医学中治疗癌症的重点之一。肺癌作为患病率及致死率均较高的癌症，其致病因素尚未完全明确。目前认为肺癌常见的致病原因是相对长期、较高频率的吸烟，长期接触致癌物、空气污染、人体免疫状况、遗传因素和代谢活动也与肺癌有关。目前，传统放化疗治疗肺癌的疗效欠佳，而免疫治疗及靶向治疗存在耐药的情况[2-3],故寻求新的治疗方案显得尤为重要。

中药具有多靶点、多环节、多层次的治疗作用。铁皮石斛作为名贵中药，《神农本草经》曰“其味甘，平。主伤中，除痹，下气，补五脏虚劳，羸瘦，强阴，久服厚肠胃，轻身延年”，《玉楸药解》亦言其能降冲泄湿、壮骨强筋。在现代中医理论中，肿瘤的形成与血瘀气滞、机体邪不胜正等有关。而铁皮石斛能填气血之海，补中焦之劳伤，五脏之虚羸，其能提高免疫力，对抗肿瘤之病邪。铁皮石斛的主要有效成分为柚皮素、毛兰素、石斛酚，现代研究表明这些活性成分可通过多途径发挥抗肿瘤作用。其中，柚皮素具有抗氧化和抗炎活性[10]，如在乳腺癌细胞中，柚皮素能通过抑制细胞增殖、调控细胞周期，使癌细胞周期阻滞在G1期，并诱导细胞凋亡[11]；其还可抑制人肺癌细胞的迁移、侵袭，诱导细胞凋亡，阻滞肿瘤进展[12]。毛兰素同样具有类似的治疗潜能，其能够调节多种癌症相关途径，包括细胞凋亡、细胞周期阻滞、侵袭、迁移、血管生成和体内外自噬[13]。毛兰素可诱导T47D人乳腺癌细胞的早期凋亡和晚期凋亡，其促凋亡作用依赖于降低B细胞淋巴瘤-2的表达和激活Caspase信号通路[14]。石斛酚亦可以调节多种癌基因相关蛋白的功能，如正向调控TP53蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖[15]。本研究应用未经过提取的纯天然鲜铁皮石斛制剂干预肺腺癌A549细胞。结果显示，鲜铁皮石斛可抑制肺腺癌A549细胞的增殖，且具有一定的浓度和时间依赖性，同时其可抑制A549细胞的迁移，提示纯天然的鲜铁皮石斛在体外具有抗肺腺癌的作用。进一步行免疫荧光实验发现，鲜铁皮石斛呈浓度依赖性地促进A549细胞凋亡。由此推测，鲜铁皮石斛可通过调控细胞凋亡从而抑制肺腺癌A549细胞的增殖与迁移。

综上所述，鲜铁皮石斛能够抑制肺腺癌A549细胞增殖及迁移能力，这一作用可能通过促进细胞凋亡而实现。实验中采用完整的鲜铁皮石斛制剂而非相应提取成分进行干预，亦是为了从根源探究中草药在传统医学中“食其气，用其味”的理论根据。