非洲猪瘟病毒检测方法研究进展

文│黄永生（深圳市质量安全检验检测研究院、深圳市动物疫病预防控制中心）

徐志远 娄华*（佛山科学技术学院）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的一种急性、热性、出血性、高度接触性的烈性传染病。该病可引起各个品种和年龄段的猪发病，其临床特征为高热、皮肤发绀、呕吐、便血、淋巴结严重出血、脾肿大3～10倍，典型败血症，发病急、病程短、死亡率高。近年来，非洲猪瘟给国内外养猪业带来巨大威胁的同时也造成了巨大的经济损失。因此，目前非洲猪瘟被称为养猪业的“头号杀手”。

非洲猪瘟病毒是目前惟一已知的虫媒DNA病毒。自1921年首次在非洲肯尼亚地区发现ASFV后，该病毒相继在西班牙、意大利、法国、比利时、马耳他以及荷兰等国家和地区被发现。20世纪90年代，该病毒在欧洲大部分地区被消灭，但仍流行于意大利撒丁岛。2007年，ASFV首次传入俄罗斯高加索地区格鲁吉亚，并于当年8月在亚美尼亚暴发流行，此后ASFV传播到乌克兰、白俄罗斯。2014年在立陶宛、爱沙尼亚、波兰、拉脱维亚相继报道非洲猪瘟疫情。2017年，意大利、罗马尼亚、捷克共和国以及匈牙利等国暴发非洲猪瘟疫情。2018年8月，我国在辽宁省沈阳市某猪场首次发现ASFV，此后我国的一些其他省份相继发生非洲猪瘟疫情。

目前，非洲猪瘟尚无安全、有效的疫苗以及特异性药物进行非洲猪瘟的防治，对其防控依然采取的是快速检测结合有效的生物安全措施为主。因而，ASF快速检测方法的建立对于ASF的诊断、疫情的确认与及时处置、防控与净化起到至关重要的作用。

一、非洲猪瘟病毒的特点

ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属中唯一的成员，其结构为复杂的二十面体结构，直径约为200纳米，基因组为线性双链DNA，基因组全长度170～190kb，包含151～167个开放阅读框，可以编码170多种蛋白，目前超过一半的蛋白功能未知。成熟病毒颗粒包含54种结构蛋白，其中病毒血清学检测方法研究最为常用的结构蛋白为p30、p54、p72。ASFV具有双层囊膜结构，对外界环境的抵抗力非常强，血清等有机质的存在也可以增加病毒的抵抗力。ASFV根据结构蛋白p72的B646L基因序列的不同可分为24种基因型，而依据病毒颗粒表面蛋白的抗原性又可以分为8种不同的血清型。ASFV是目前惟一已知的虫媒DNA病毒，钝缘蜱是其重要的传播媒介。ASFV可以借助口鼻间接触与破损的皮肤进行直接接触的水平方向传播，也可以通过粪便、尿液、唾液等排泄物或分泌物的接触进行间接接触传播。除此之外，相关研究还表明，ASFV还可以借助气溶胶进行短距离传播。ASFV在未熟制肉品、冻肉、腌肉、泔水中可以长时间存活，在粪便以及受污染的猪舍内可以存活30天之久，猪只饲喂泔水也是引起ASFV传播的重要途径。

二、免疫学检测方法

1.酶联免疫吸附试验。酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assey，ELISA）是OIE推荐的用于ASFV诊断最常用的血清学检测方法。ELISA的原理是将某种酶与抗体结合形成酶标抗体，然后与吸附于固相载体上的相应的抗原或者抗体发生特异性结合反应，加入底物溶液，发生酶分子催化反应，呈现不同的颜色变化，据此来判断抗原或抗体的含量。根据检测靶标的不同，可以将其分为直接ELISA、间接ELISA、双夹心ELISA以及阻断ELISA。采用ELISA方法进行ASFV检测时，对于抗原检测最为常用的靶标为p30、p54、p72、p32、K205R。ELISA方法具有操作简便、质优价廉、实用性强、快速以及对仪器设备要求不高的优点，适用于ASFV的大规模流行病学调查以及定期监测。Barderas等利用制备的重组p30蛋白开发了检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA方法，实现了对ASFV的特异性抗体的检测。Cubillos等基于ASFV东非分离株制备出了重组p30蛋白，并设计了相应的ELISA诊断方法，经检测可以准确检测出ASFV。Wardley等以抗ASFV的特异性抗体IgG为包被单抗，设计了间接ELISA试验，实现了对ASFV抗原的检测，其最低检测浓度为50HAD50/毫升，上限检测浓度为500HAD50/毫升。Perez Filgueira D M等借助昆虫细胞表达的重组蛋白p30作为包被抗原，设计了间接ELISA检测方法用于非洲猪瘟病毒抗体的检测，对采样于西班牙以及来自非洲不同地区的672份猪血取其血清作为样品检测，可以检测到非洲猪瘟病毒的特异性抗体，同时，通过此种方法可以实现对ASFV早期感染样品的检测。因此，也证实了此种间接ELISA检测方法具有较高的敏感性。邬旭龙等依据原核表达的pk205R蛋白为包被抗原，设立了检测ASFV抗体的间接ELISA诊断方法。由此表明，ELISA检测方法及开发的相关试剂盒在ASFV的检测中得到了广泛应用。

2.免疫荧光试验。免疫荧光试验（Immunofluorescence assey，IFA）的原理是利用荧光素标记相应的抗原或抗体，使之与其相对应的抗体或抗原发生特异性结合，形成抗原—抗体免疫复合物，在荧光显微镜下观察，实现对未知抗原或抗体的检测。根据其检测靶标是抗原或抗体，可以将其分为直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验。直接免疫荧光试验的原理是利用荧光素（如异硫氰酸荧光素）标记抗ASFV的特异性单抗或多抗，将其与组织触片以及薄层冷冻切片上的抗原直接发生反应后镜检，实现对ASFV的抗原检测。此种方法具有特异性强、灵敏度高的优点，但也存在不足之处，如对操作技术要求高、对实验室设备要求高以及需要特定的操作环境等。间接免疫荧光试验的原理是将感染ASFV的细胞（如原代以及传代培养细胞）固定于固相载体（载玻片）上，加入待检测血清，使之发生特异性反应，若待检测的血清样品中含有ASFV的特异性抗体，则会与含有ASFV抗原的特定细胞进行结合，进而会与荧光染料标记的二抗发生特异性结合，形成特异性荧光复合物，通过荧光显微镜观察可对此复合物做出判断。此种检测方法与直接免疫荧光试验存在一样的不足之处。免疫荧光试验对于急性感染ASFV猪只样品检测的敏感性较高，但不适用于亚急性及慢性感染猪只的检测。Heuschele等通过免疫荧光试验实现了对不产生红细胞吸附现象的ASFV的检测。

3.免疫印迹试验。免疫印迹试验（Immunoblotting test，IBT）的原理是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得到的蛋白质转移到膜上，通过一抗与二抗的孵育，实现对ASFV抗原或抗体的检测，这是一种凝胶电泳与免疫分析化学技术相结合的检测技术。免疫印迹试验具有特异性强、灵敏度高、准确性好、高通量的优点，同时对于含有细胞化合物的抗原进行检测时假阳性率低，但操作烦琐，对实验设备以及实际试验操作环境要求较高，此种方法仅适用于实验室检测。Kazakova等基于其制备的较高纯度重组表达p30蛋白开发了相对应的免疫印迹检测方法，实现了对ASFV感染猪只的血清及组织样品的检测，具有非常高的特异性和敏感性。对于家猪或野猪以及自然感染状态下的猪只，可在感染ASFV后6～8天从其血清或组织器官中检出相应的特异性抗体。

4.胶体金免疫层析法。胶体金免疫层析法（C o l l o i d a l g o l d immunochromatography，GICA）是以胶体金作为示踪标记物用于抗原或抗体检测的新型固相载体免疫检测技术。胶体金免疫层析试纸条包括质控线和检测线两部分，质控线是保证试纸条是完好的，而检测线的存在是对样本进行检测，检测线的存在与否用于检测结果的判断。此种检测方法具有易操作性、实用性、快速、便携、费用低、特异性好的优点，不需要专业的仪器设备，肉眼即可进行检测结果判断等优点，但对于检测样本浓度有一定的要求。胶体金免疫层析试纸条适用于ASFV的现场快速初步诊断、ASFV的流行病学调查以及定期监测、急性感染、疑似感染与病死猪的检测，但不适用于ASFV感染的早期检测。Sastre等基于制备的抗ASFV结构蛋白p72的单克隆抗体，建立了用于ASFV抗原检测的免疫层析试纸条。张鑫宇等基于制备的抗ASFV的p54蛋白的抗体，建立了具有较高特异性的胶体金免疫层析检测法。林彦星等利用量子点标记葡萄球菌A蛋白，建立了相应的量子点免疫层析检测技术，可用于ASFV抗体的快速检测。吴海涛等基于原核表达的ASFV衣壳蛋白PET-30A-P72，利用双抗体夹心法原理，制备了纯化的用于胶体金标记的特异性多抗，建立了具有较高灵敏度的胶体金免疫层析抗原检测法。

三、核酸检测方法

1.常规PCR检测法。常规PCR（Polymerase chain reaction) ，称为聚合酶链式反应。这种检测方法依据的是双链扩增的原理，在引物、模板DNA以及4种脱氧核苷酸存在的情况下，在DNA聚合酶的催化作用下，依据碱基互补配对原则，在体外实现目的DNA片段的指数级扩增。常规PCR检测方法是OIE推荐的用于ASFV诊断的核酸检测方法，也是当前实验室较为实用的ASFV鉴别诊断方法。常规PCR检测法具有特异性高、灵敏度高、简便快速的优点，且可实现扩增反应终点产物的定性或半定量分析。这种检测方法需要专业的热循环仪，对操作人员的技术要求高，需要特定的实验室环境条件等，因而并不适用于ASFV的现场快速检测，是用于ASFV确诊的实验室检测方法。Aguero M等建立了用于ASFV感染的早期诊断的PCR检测方法，具有较高的特异性和敏感性。Giammarioli等建立了用于非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）以及猪细小病毒（PPV）的检测与鉴别诊断的多重PCR。张倩等建立了用于PRRSV、PCV-2、PPV以及PRV鉴别诊断的多重PCR检测方法，经过实际样品的检测，发现其具有较高的敏感性。Hu等建立了用于ASFV、PRRSV以及PRV鉴别诊断的三重PCR检测方法。Luo等基于ASFV的P72蛋白基因高度保守区域设计特异性引物，建立了相应的PCR检测方法，其检测限为60个拷贝。

2.荧光定量PCR检测法。荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）的原理是在反应体系中加入荧光基团，通过捕捉荧光信号来追踪扩增反应产物，实现PCR反应进程的实时监测，最终通过呈现的标准曲线实现初始反应模板定量分析。这种检测方法具有特异性强、灵敏性极高、稳定性好、操作简便、准确性及可靠性高的优点。因其具有极高灵敏度的特点，更需注重规范操作过程。相对于常规PCR而言，反应更为迅速，且闭管操作污染小。这种检测方法同样需要专业的热循环仪，对仪器设备要求及试验条件要求高，只适用于实验室检测。荧光定量PCR检测法是非洲猪瘟病毒检测最为常用的实验室检测方法。King等基于ASFV的VP72特定基因序列设计特异性引物及TaqMan探针，建立了检测ASFV的荧光定量PCR检测方法，检测限为40个拷贝。郭少平等基于ASFV的K205R基因序列构建了荧光定量PCR检测方法。张彩虹等基于ASFV的VP72基因序列设计相应的引物和探针，构建了只针对ASFV检测的荧光定量PCR检测方法，具有高度的特异性和敏感性的特点。王建华等依据ASVF的CP530R（pp62）基因序列以及高致病性PRRSV的NSP2基因序列，分别设计相对应的特异性引物和TaqMan探针，建立了用于ASFV与高致病性PRRSV鉴别诊断的荧光定量PCR检测方法。王彩霞等基于ASFV的CD2v基因序列设计对应的引物和探针，构建了ASFV检测的荧光定量PCR，最低检测限为10个拷贝。Haines F J等依据ASFV和CSFV的基因序列建立了具有较高灵敏度的双重鉴别诊断荧光定量PCR检测方法。由此可见，荧光定量PCR检测法是ASFV检测应用最为广泛且精准度最高的检测技术。

3.等温扩增技术。等温扩增技术是一种恒温条件下依赖于DNA酶作用的新型核酸扩增技术。常见的等温扩增技术主要包括环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重组聚合酶扩增技术（Recombinase protein amplification，RPA）、交叉引物扩增技术（C r o s s i n g Priming Amplification，CPA）、滚环扩增技术（R o l l i n g c i r c l e amplification，RCA）以及杂交链式反应（Hybridization chain reaction，HCR）。等温扩增技术具有简便、快速、便携、耗费低以及敏感度高的优点，对仪器设备、操作人员技术、试验条件等要求不高，且检测结果的判断更为直观，更适合于现场快速诊断。James H E等基于ASFV的拓扑异构酶基因Ⅱ建立了用于ASFV快速诊断的高特异性的LAMP检测法，检测时长为30分钟，相对于其他检测方法而言耗时短。王建昌等依据ASFV的VP72基因序列建立了用于ASFV快速检测的RPA技术。Fan等基于ASFV的B646L基因序列设计特异性引物，设计了用于ASFV检测的高特异性的重组聚合酶辅助扩增检测法。

4.其他核酸检测方法。除了上述三类常见基于非洲猪瘟病毒核酸的检测方法，还有数字PCR、纳米PCR、探针杂交技术、微流控芯片技术以及CRISPR/Cas系统等核酸检测方法。CRISPR/Cas系统是一种新型的核酸检测方法，如今已成为研究人员对于非洲猪瘟病毒检测关注的焦点。王鑫杰等基于CRISPR/Cas系统，建立了ASFV的核酸快速检测方法，并开发了相应的Cpf1试剂盒。郭春和等基于CRISPR/Cas12a系统，建立了针对ASFV的精准快速检测方法。

四、总结

近年来，非洲猪瘟给国内外的养猪业构成了巨大的威胁，造成了巨大的经济损失。因此，非洲猪瘟病毒快速检测方法的建立显得尤为重要。非洲猪瘟病毒快速检测方法的建立，可以为ASF诊断、疫情确认与及时处置、防控以及净化提供重要的技术手段。随着现代科技的发展，特别是分子水平检测技术的发展，在保证检测方法的特异性、敏感性、准确性以及可靠性的前提下，ASFV的检测将会向着集约化、工业化、自动化、高通量、高性能、低成本方向发展，检测用仪器设备也会向着微型化、便携化趋势发展，向社会提供随时随地、精准快速的检测技术。