TiN-Ag@Ag SERS基底制备及其对腺嘌呤的检测性能与增强机制研究

安晓洁，赵 静，裴 媛，王志武，刘艳坤，李 波，魏颖娜，魏恒勇，吴振刚*，李景武*

（1．华北理工大学 药学院，河北 唐山 063210；2．唐山市人民医院，河北 唐山 063001；3．华北科技学院河北危险化学品安全与控制技术重点实验室，河北 廊坊 065201；4．华北理工大学材料科学与工程学院，河北 唐山 063210）

表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）可通过粗糙金属或半导体表面增强效应提升被检测物的拉曼信号，具有快速、特异性强以及可进行单分子检测的特点，自被发现［1-2］以来一直备受关注。SERS技术在药物分子检测等领域有着广泛的应用［3］，其中腺嘌呤分子的低浓度SERS检测对生物和医学研究及应用有着重要意义［4］。

腺嘌呤分子是一个十分重要的生物分子，是核酸的4种核碱基之一，参与RNA和DNA合成，也是生命能量物质ATP的重要组成部分。DNA分子的SERS信号中腺嘌呤为主导信号，对腺嘌呤的SERS进行检测是检测DNA的有效分析手段［5］。此外，体内腺嘌呤含量的变化可能会引起肺癌的发生，因此体内腺嘌呤的含量也可视为早期肺癌的重要判断依据。汤钊［6］以抗坏血酸为还原剂制备银溶胶，并以其为增强基底对腺嘌呤水溶液及尿液样进行了SERS检测，发现银溶胶表现出SERS增强效果。

银溶胶是目前SERS基底的常用材料之一，陈志杰等［7］使用银溶胶为SERS基底对水和尿液中的舒芬太尼进行了检测。但由于银的化学性质不稳定，导致SERS检测的应用范围受限［8］。氮化钛（TiN）的热稳定性、化学稳定性以及生物兼容性优异，同时展现出良好的SERS性能［9］。基于此制备贵金属∕氮化钛复合基底，可改善贵金属材料的稳定性和生物相容性，并提升基底的SERS活性。Ban等［10］通过制备TiN-Ag复合基底，利用Ag与TiN之间的电荷转移和较强的局部电磁场耦合效应，大幅提高了基底的SERS灵敏度，同时基底的耐久性也得到了改善。Liu等［11］制备的Ag∕Au∕TiN复合薄膜凭借Ag∕Au∕TiN三者的耦合效应，使得基底的SERS效应显著增强。Wang等［12］制备的Au@TiNx纳米结构也表现出拉曼散射增强效果。Ma等［13］通过在包裹Ag的TiN基底上组装Au纳米颗粒，借助Ag、TiN和Au之间的协同作用实现了良好的表面增强拉曼效果。利用贵金属和TiN材料良好的协同耦合作用开发高性能的SERS基底，探讨其在生物医药领域的应用成为当前的研究热点之一。

本文采用电沉积及自组装法制备了TiN@Ag溶胶、TiN-Ag薄膜、TiN-Ag@Ag溶胶3种复合SERS基底，探讨了3种基底对腺嘌呤的拉曼检测性能，并分析了其拉曼增强机制。

1 实验部分

1.1 试 剂

四氯化钛（TiCl4）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，130 × 104）以及腺嘌呤均购自上海阿拉丁试剂网；无水乙醇购自天津市兴复精细化工研究所；硝酸银（AgNO3）、柠檬酸三钠购自国药集团化学试剂有限公司；氨气（99．99%）和氮气（99．99%）购自唐山市路北区万嘉气体经销处。

1.2 SERS基底的制备

参考文献［11］制备TiN薄膜与Ag溶胶。TiN薄膜制备：取6 mL四氯化钛乙醇溶液，加入10 mL无水乙醇，2．5 mL DMF，1 g PVP，搅拌溶解。随后以匀胶仪石英基片镀膜，时间为20 s，转速为3 500 r∕min。于烘箱80 ℃干燥24 h后，600 ℃下预烧，保温30 min得到TiO2膜。将TiO2膜放入管式炉，以5 ℃∕min的速度升温至1 000 ℃，之后通入800 mL∕min的NH3，保温2 h，得到TiN薄膜。

Ag溶胶制备：取AgNO30．018 g加至100 mL去离子水中溶解，在水浴中加热搅拌至沸腾。当温度达到100 ℃时，滴加2 mL 0．1 g∕mL的柠檬酸钠，反应1 h得到黄绿色的Ag溶胶溶液。

TiN-Ag薄膜基底制备：取0．016 9 g AgNO3溶解于20 mL去离子水中，得到浓度为5 mmol∕L的AgNO3沉积液。以TiN薄膜基底为工作电极，金属Pt为对电极，电压为5 V，沉积时间为5 min，制备TiN-Ag薄膜基底。

TiN@Ag溶胶基底制备：将Ag溶胶在8 000 r∕min下离心10 min，除去上清液，将得到的下层液体与样品混合均匀滴加在TiN薄膜表面，即得到TiN@Ag溶胶基底。

TiN-Ag@Ag溶胶基底制备：将Ag溶胶在8 000 r∕min下离心10 min，除去上清液，将得到的下层液体与样品混合均匀滴加在TiN-Ag薄膜的表面，即得到TiN-Ag@Ag溶胶基底。

1.3 SERS检测与表征

将腺嘌呤溶于去离子水中配制成不同浓度的溶液，滴加在TiN-Ag基底或与Ag溶胶1∶1混匀滴加在TiN和TiN-Ag基底上。采用DXR激光拉曼光谱仪（美国热电公司）在激发波长为633 nm，功率为1 mW，物镜为10 ×，采集时间为10 s的条件下进行SERS检测，对每个样品进行打点数据收集，点数为8。

采用JEM-2800F透射电子显微镜（TEM，日本电子株式会社）观测所合成Ag溶胶的形貌；利用Zetasizer Nano ZS90纳米粒度分析仪（英国马尔文公司）测定Ag溶胶的粒径分布；借助D∕MAX2500PC X射线衍射仪（XRD，日本理学株式会社）和S-4800场发射扫描电子显微镜（SEM，日本日立株式会社）分析基底物相组成和微观形貌；采用Lambda 750S紫外-可见分光光度计（美国Perkinelmer公司）测试样品的吸收曲线；利用Thermo 250X紫外光电子能谱（美国Thermo Fisher Scientific公司）测试薄膜的功函数和价带导带位置。

2 结果与讨论

2.1 TiN-Ag@Ag溶胶复合SERS基底的表征

利用透射电子显微镜观察Ag溶胶的颗粒形貌，结果显示合成的Ag溶胶纳米颗粒呈准球形，粒径为50 ～ 100 nm，其衍射环明显，表明合成的Ag溶胶为金属Ag单质（图1A）。同时在高分辨率图像中观察到其晶格边缘间距为0．23 nm（图1B），与单质Ag晶体的（111）晶面相对应。利用紫外-可见分光光度计表征其等离子共振吸收峰，发现在419 nm附近出现了Ag纳米颗粒的等离子体共振吸收峰［14-15］。以上结果表明，柠檬酸钠将硝酸银还原成Ag单质纳米粒子。

图1 Ag溶胶的TEM图（A ～ B）及其UV-Vis光谱（C）Fig．1 TEM images of Ag sol（A-B） and its’UV-Vis spectrum（C）

对TiN@Ag溶胶、TiN-Ag薄膜、TiN-Ag@Ag溶胶3种复合基底进行XRD测试，结果如图2A所示。XRD图表明，TiN的（111）和（200）衍射峰分别出 现 在36．9°和42．9°。单 质Ag晶 体 的（111）、（200）、（220）和（311）衍射峰分别出现在38．2°、44．4°、64．6°和77．4°。在TiN-Ag@Ag溶 胶 的XRD图谱中，Ag单质（111）的特征衍射峰越来越尖锐，表明越来越多的Ag单质聚集在TiN表面，并优先沿（111）面择优生长。图2B则显示了3种基底的UV-Vis图，如图所示，400 ～ 600 nm处出现了共振吸收峰，与a和b相比，曲线c的吸收峰位置有红移，表明Ag聚集在TiN表面，Ag和TiN之间存在共振耦合。

图2 TiN@Ag溶胶（a）、TiN-Ag薄膜（b）、TiN-Ag@Ag溶胶（c）基底的XRD图（A）和UV-Vis图（B）Fig．2 XRD spectra（A） and UV-Vis spectra（B） of TiN@Ag sol（a），TiN-Ag film（b），TiN-Ag@Ag sol（c）

TiN@Ag溶胶、TiN-Ag薄 膜 和TiN-Ag@Ag溶胶的SEM形貌如图3所示。图3A显示，少量的Ag纳米粒子聚集在TiN薄膜的表面上。而TiN薄膜上沉积Ag后，其表面出现Ag纳米棒，并呈现出树枝状的结构（图3B）。图3C表明TiN-Ag基底上复合Ag溶胶后，Ag纳米粒子分布在TiN薄膜表面沉积的Ag纳米棒周围。

图3 TiN@Ag溶胶（A）、TiN-Ag薄膜（B）、TiN-Ag@Ag溶胶（C）的SEM图Fig．3 SEM diagrams of TiN@Ag sol（A），TiN-Ag film（B） and TiN-Ag@Ag sol（C）

2.2 腺嘌呤理论图谱与拉曼检测

通过Gaussian软件利用密度泛函理论（DFT）优化了腺嘌呤的结构并计算了其理论拉曼图谱，如图4所示。对腺嘌呤粉体进行常规拉曼（NRS）测试，并以TiN-Ag薄膜为SERS基底，对0．01 mol∕L的腺嘌呤溶液进行SERS检测，结果如图5所示。可以看出，与理论拉曼图谱相比，腺嘌呤的常规拉曼谱、SERS图谱中的部分拉曼峰位发生了偏移，但其基本特征峰较为吻合，主要特征峰归属见表1。造成峰位偏移的原因可能是腺嘌呤吸附在增强基底上时分子的构型和偶极距发生了改变，也可能是理论计算中过多的电子以及外部溶剂的参与造成。

表1 腺嘌呤的DFT、NRS和SERS光谱归属Table 1 DFT，NRS and SERS spectral attribution of adenine

图4 DFT优化的腺嘌呤结构（A）及其理论拉曼图谱（B）Fig．4 DFT-optimized adenine structure（A） and its theoretical Raman atlas（B）

图5 腺嘌呤的常规拉曼图谱（A，粉体）及SERS图谱（B，溶液）Fig．5 Conventional Raman atlas（A，powder） and SERS atlas（B，solution） of adenine

2.3 不同基底对腺嘌呤的SERS检测性能分析

将0．01 mol∕L的腺嘌呤溶液（0．013 5 g，10 mL去离子水）分别吸附在TiN@Ag溶胶、TiN-Ag薄膜和TiN-Ag@Ag溶胶3种基底上，研究不同基底对腺嘌呤的拉曼增强性能。图6A显示，TiN-Ag薄膜基底的拉曼增强性能优于在TiN@Ag溶胶基底；与另两种基底相比，TiN-Ag@Ag溶胶作为基底的拉曼性能增强效果最强。图6B显示了腺嘌呤在不同基底上于740 cm-1和1 330 cm-1处的信号峰强度，可以看出其在TiN-Ag@Ag溶胶基底上特征峰的拉曼强度最高。

图6 不同基底上腺嘌呤的SERS光谱（A）及其特征峰的拉曼强度（B）Fig．6 SERS spectra of adenine on different substrates（A） and adenine characteristic peak Raman intensity（B）

将腺嘌呤配成10-2、10-3、10-4、10-5mol∕L浓度梯度的溶液，以TiN-Ag@Ag溶胶为基底测试其SERS检出限，结果见图7。可以看出，随着腺嘌呤溶液浓度的递降，腺嘌呤的SERS信号强度呈现降低的趋势。以腺嘌呤的溶液浓度（X）与相对应的728 cm-1处的拉曼强度（Y）取对数之后绘制标准曲线，得到Y =0．408X +3．843，相关系数（r2）为0．989 5。从图中可以看出，当溶液浓度低至10-5mol∕L时，仍可观察到728 cm-1处特征峰的拉曼信号，因此腺嘌呤在TiN-Ag@Ag溶胶基底上的检出限可达10-5mol∕L。说明该基底适用性尚可，且灵敏度较高。与其他Ag纳米基底［16］相比，本文基底制备过程简单，TiN薄膜基底机械性能好且稳定［17］，在空气中放置两周仍可有较好的拉曼增强效应，具有一定的应用前景。

图7 不同浓度腺嘌呤在TiN-Ag@Ag溶胶基底上的SERS图谱Fig．7 SERS spectra of different concentrations of adenine on the TiN-Ag@Ag sol substrate

2.4 SERS增强机制分析

测定了TiN薄膜的紫外光电子光谱（UPS）（图8），确定TiN的UPS宽度为14．05 eV（16．55-2．50），TiN-Ag复合 后的UPS宽 度为13．26 eV（16．68-3．42）。通过将激发能（21．22 eV）与UPS光谱的宽度相减，估计出TiN基底的VB位于-7．17 eV，并得到功函数Φ为-4．67 eV，由于功函数为真空能级减去费米能级后得到的值，由此可知其费米能级位置。同理得到TiN-Ag复合后的功 函 数 为-4．54 eV。TiN薄 膜 的 禁 带 宽 度［18］为2．73 eV，利用ECB带=EVB-Eg（ECB、EVB、Eg分别代表半导体材料的导带电势、价带电势和禁带宽度），得到TiN的CB位于-4．44 eV。结合高斯软件中密度泛函理论计算腺嘌呤的LUMO和HOMO位置，得到其LUMO和HOMO分别为-0．99 eV和-6．34 eV。由图9可知，电荷可以很好地从Ag转移到TiN中，直至二者的轨道能级差相同，由于转移过程，TiN-Ag界面内会产生电荷积累和一定的电势，这对局部电磁场效应非常有利，因此，TiN-Ag复合后的基底拉曼性能提高，由于复合基底与腺嘌呤分子之间也存在电荷转移，故腺嘌呤的拉曼信号更为增强。此外，当药物的HOMO和LUMO位置与腺嘌呤相似时，则基底与分析物分子之间同样存在电荷转移，如使用此基底对对乙酰氨基苯酚、茶碱、布洛芬、恩诺沙星等药物进行SERS检测也可以得到很好的SERS增强效应。

图8 TiN（A）和TiN-Ag（B）的UPS光谱Fig．8 UPS spectra of TiN（A） and TiN-Ag（B）

图9 TiN-Ag复合基底与腺嘌呤之间的电荷转移示意图Fig．9 Schematic diagram of charge transfer between TiN-Ag composite substrate and adenine

为对Ag溶胶、TiN@Ag溶胶、TiN-Ag薄膜、TiN-Ag@Ag溶胶基底的电场分布以及SERS增强机制进一步分析，选择400 ～ 700 nm波长的光沿着y轴方向射入，利用时域有限分差法（FDTD）对基底进行模拟，结果如图10所示。比较Ag溶胶基底与TiN@Ag溶胶发现，TiN薄膜上复合Ag溶胶纳米粒子后，在TiN薄膜与Ag纳米颗粒的结合处出现明显的“热点”，提高了局域电场强度（图10A ～ B）。TiN-Ag薄膜基底（图10C）比TiN@Ag溶胶基底的电场强度强，是因为TiN薄膜与Ag纳米棒的结合产生了明显的表面等离子体耦合效应。从图10D可以看到，在TiN-Ag薄膜上复合Ag溶胶后，使得基底的电场强度增强效应更为显著，可能是因为TiN-Ag@Ag溶胶基底上除了具有TiN薄膜与Ag纳米颗粒发生共振耦合作用明显出现的“热点”外，还具有Ag纳米颗粒聚集在Ag纳米棒之间形成的纳米间隙提供的更多“热点”，而“热点”位置具有更强的表面等离子体共振效应，“热点”越多增强效应越好，最终使得该基底的SERS活性增强最为显著［19-20］。

图10 不同基底的2D-FDTD模拟图Fig．10 2D-FDTD simulation diagrams of different substrates

3 结 论

本研究成功制备了TiN@Ag溶胶、TiN-Ag薄膜及TiN-Ag@Ag溶胶3种复合基底，结果显示纳米Ag均匀分布在TiN表面，Ag和TiN之间存在共振耦合作用。利用UPS和FDTD对基底的增强机制进行分析，发现TiN-Ag@Ag溶胶基底的电场强度明显比另外两种基底更强，该基底除了具有TiN薄膜与Ag纳米颗粒发生共振耦合作用明显出现的“热点”外，还具有因Ag纳米颗粒聚集在Ag纳米棒之间形成纳米间隙而提供的更多“热点”，而“热点”位置具有更强的表面等离子体共振效应，同时存在电荷转移，使得SERS活性明显提高。利用该复合基底对腺嘌呤溶液进行SERS检测，检出限可达10-5mol∕L。