胎儿颈项透明层厚度检测联合母体血浆miR-22-3p、RIPK1浓度对胎儿先天性心脏病的诊断价值

侯广霞，臧鹏程，赵 丽，董晓菁

（1.北部战区总医院妇产科，沈阳 110016；2.辽宁中医药大学附属第二院电检科，沈阳 110034）

先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）是先天畸形最常见的类型之一，我国CHD 的发病率约为1%，是出生缺陷引起胎儿死亡的最重要原因之一，严重影响患儿生存质量，给家庭造成负担，因此，对胎儿CHD 做出早期诊断，及时干预治疗对于改善不良妊娠结局具有重要意义［1-2］。研究显示，妊娠早期胎儿颈项透明层（nuchal translu⁃cency，NT）增厚与胎儿心脏畸形、染色体异常、唐氏综合征等不良妊娠结局发生密切相关，彩色多普勒超声（彩超）检测胎儿NT 厚度在筛查胎儿CHD 中具有重要应用价值［3］，但单一检测灵敏度不高，联合其他血液学指标检测可提高检测准确性。母体血循环中的微小RNA（microRNA，miR）在胎儿生长受限、子痫、胎儿畸形等妊娠相关疾病中异常表达，可作为其产前诊断的标志物［4-5］。MiR-22-3p 为miR 其中之一，研究显示，miR-22-3p 与慢性心力衰竭患者不良预后有关［6］。受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（receptor-inter⁃acting serine/threonine protein kinase 1，RIPK1）是程序性坏死中关键的蛋白质分子，参与心肌缺血再灌注损伤、冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）等多种心血管疾病的发生、发展［7］。研究表明，冠心病患者血浆RIPK1 浓度升高，对患者预后的评估具有一定价值［8］。目前miR-22-3p、RIPK1 在胎儿CHD 中的报道不多。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测孕妇血浆miR-22-3p 浓度，酶联免疫吸附法检测孕妇血浆RIPK1 浓度，超声检查胎儿NT 厚度，探讨NT 厚度联合血浆miR-22-3p、RIPK1 浓度对胎儿CHD 的预测价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择2018 年3 月至2020 年10 月在北部战区总医院产科确诊怀有CHD 胎儿的孕妇57 例为观察对象（CHD 组），年龄为（28.50±5.80）岁，孕周为11～13+6 周。本组孕妇产后经病理或超声结果证实法洛四联症14 例、右位主动脉弓10 例、瓣膜畸形7 例、大动脉转位6 例、室间隔缺损10 例、单心室3 例、主动脉弓离断4 例、左旋心3 例。纳入标准：（1）产后经病理或超声结果证实心脏畸形；（2）均为自然妊娠且为单胎的孕妇，11～13+6 周；（3）接受早孕期胎儿NT 厚度测量；（4）随访至妊娠结束。排除标准：（1）胎儿合并其他部位畸形；（2）有CHD 家族史、既往存在原发性高血压（高血压）、肝和肾疾病、心脑血管疾病及糖尿病等；（3）孕妇不能按照规定时间产检或不配合随访，孕期有阴道大出血或急性胎儿宫内窘迫等；（4）孕妇早孕期服用抗惊厥、高血压等致畸性药物或食物；（5）临床资料不全。选择同期怀有健康胎儿的孕妇60 名为对照组，且接受早孕期胎儿NT 厚度测量，无CHD 家族史，年龄为（28.70±6.10）岁，孕周11～13+6 周。本研究样本采集均经过本院伦理委员会批准（伦理批号：20180315），受试对象签署知情同意书。另收集胎儿性别等资料。

1.2 主要试剂与仪器

TRIzol reagent 购自美国Invitrogen 公司，逆转录试剂盒（miScript II RT Kit）、miScript SYBR Green PCR Kit 购自德国QIAGEN 公司，人RIPK1 ELISA Kit 购自上海信裕生物科技有限公司，Applied Bio⁃systems ABI 7500 型定量PCR 仪购自ABI 公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及保存 采集所有孕妇外周静脉血5 mL，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，低温下3 000 r/min，离心10 min后收集血浆，置于-80℃冰箱保存备用。

1.3.2 血浆受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1浓度检测 采用酶联免疫吸附方法检测血浆RIPK1 浓度，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.3.3 血浆微小RNA-22-3p浓度检测 使用TRIzol试剂提取血浆总RNA，使用miScriptⅡRT Kit 逆转录得到cDNA，置于-20 ℃保存备用。采用实时荧光定量PCR 检测miR-22-3p 的表达。反应结束后，以U6 为内参，miR-22-3p 浓度采用2-ΔΔCT分析法进行计算。MiR-22-3p 上游引物序列（5'-3'）：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAG⁃TTGAACAGTTCT，下游引物序列（5'-3'）：ACAC⁃TCCAGCTGGGAAGCTGCCAGTTGAAGAA；U6 上游引物序列（5'-3'）：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物序列（5'-3'）：AACGCTTCACGAATTTGC⁃GT。

1.3.4 胎儿颈项透明层厚度检查 两组观察对象在妊娠11～13+6 周时采用超声检测胎儿NT 厚度，采用美国GE 公司的GE-E8 彩色多普勒超声诊断仪，检测探头频率为3.5 MHz，检查时孕妇取仰卧位，首先对胎儿进行常规超声检测，检查胎儿生长情况，取胎儿面部正中矢状切面，测量头臀长与胎儿NT的厚度。胎儿NT厚度≥2.5 mm则为NT增厚，连续测量3 次，取最大值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0 进行统计学分析。计量资料以（）表示，两组间比较采用t检验。计数资料以［n（%）］表示，两组间比较采用卡方（χ2）检验。以Pearson 法 分析miR-22-3p、RIPK1 的相关性。以受试者工作特性曲线（receiver operating charac⁃teristic curves，ROC）分析胎儿NT 厚度联合血浆miR-22-3p、RIPK1 在妊娠早期诊断胎儿CHD 的价值。若P＜0.05，则差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组观察对象的一般资料比较

两组孕妇年龄、孕周及胎儿性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05），详见表1。

表1 两组观察对象一般资料比较 ［n（%），±s］

表1 两组观察对象一般资料比较 ［n（%），±s］

2.2 两组观察对象颈项透明层检查结果比较

结果显示，与对照组比较，CHD 组胎儿NT 厚度增加，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表2。

表2 两组观察对象NT 检查结果比较 ［±s］

表2 两组观察对象NT 检查结果比较 ［±s］

2.3 两组观察对象血浆RIPK1、miR-22-3p 浓度比较

与对照组比较，CHD 组血浆RIPK1 浓度显著升高，miR-22-3p 浓度显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表3。

表3 两组观察对象血浆RIPK1、miR-22-3p 浓度比较 ［±s］

表3 两组观察对象血浆RIPK1、miR-22-3p 浓度比较 ［±s］

2.4 miR-22-3p、RIPK1 的相关性分析结果

相关性分析显示，CHD 组血浆miR-22-3p 与RIPK1 浓度呈负相关性（r=-0.448，P＜0.05），详见图1。

图1 CHD 组血浆miR-22-3p 与RIPK1 的相关性散点图

2.5 NT 厚度联合血浆miR-22-3p、RIPK1 对胎儿CHD 的预测价值

NT 厚度预测胎儿CHD 的敏感度为85.96%，特异度为78.33%，截断值为2.37 mm，曲线下面积为0.836。血浆miR-22-3p 预测胎儿CHD 的敏感度为85.96%，特异度为81.67%，截断值为0.860，曲线下面积为0.823。血浆RIPK1预测胎儿CHD 的敏感度为80.70%，特异度为85.00%，曲线下面积为0.832，截断值为3.12 ng/mL。NT 厚度、血浆miR-22-3p、RIPK1 联合预测胎儿CHD 的敏感度为89.47%，特异度为85.00%，曲线下面积为0.933，敏感度及曲线下面积均高于NT 厚度及血浆miR-22-3p、RIPK1 单独检测，详见图2。

图2 NT 厚度联合血浆miR-22-3p、RIPK1 对胎儿CHD 的预测的ROC 图

3 讨论

CHD 可由多种因素引起，在胚胎发育过程中导致心血管畸形，胎儿出生后会出现生长发育差，引发呼吸急促、心力衰竭等严重症状甚至胎儿死亡，影响患儿生活质量及生存年限［9］。胎儿在发育过程若染色体异常和循环系统异常，NT 厚度会增加，孕妇常在妊娠10～14 周采用超声检测胎儿NT，以排除胎儿生长发育畸形［10］。研究表明，CHD 胎儿NT 厚度增加，其诊断CHD 的灵敏度、特异度分别为84.13%、78.46%，可作为诊断胎儿CHD 的良好指标［11］。本研究结果显示，与对照组比较，CHD 组胎儿NT 厚度增加，且NT 厚度预测胎儿CHD 的敏感度为85.96%，特异度为78.33%，表明NT 厚度可提示心脏发育异常，对胎儿CHD 具一定预测价值，与先前报道结果类似。

MiRNA 可通过胎盘屏障进入孕妇血循环，与胎儿的生长发育关联密切，当胎儿出现异常情况时，异常表达的miRNA 进入母体血液中，作为潜在妊娠相关疾病的生物标志物，多项报道显示，多种miRNA 与胎儿CHD 的发生有关［12-13］。另有研究显示，在使用血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）建立心肌梗死后心肌纤维化模型中，miR-22-3p 表达下调，过表达miR-22-3p 可靶向抑制血小板活化因子受体（platelet activating factor recep⁃tor，PTAFR）的表达，显著抑制心肌纤维化［14］。国内学者朱莎莎等［15］通过对孕早期母体血清中miRNAs表达筛查胎儿CHD 结果显示，miR-22具有筛查胎儿CHD 的价值，ROC 曲线下面积为0.671，95%CI 为0.525～0.816，其灵敏度88.90%和特异度85.20%均较高，其认为miR-22 可作为产前筛查胎儿CHD的生物标志物。本研究结果显示，CHD组母体血浆中miR-22-3p 浓度比对照组显著降低，血浆miR-22-3p 预测胎儿CHD 的敏感度为85.96%，特异度为81.67%，截断值为0.860，曲线下面积为0.823，本研究与上述学者的研究结果基本一致，提示miR-22-3p 表达水平降低可能与胎儿心脏发育畸形有关，推测miR-22-3p 可能是影响心肌损伤，造成胎儿CHD 的关键的生物标志物。

RIPK1 是一类丝/苏氨酸激酶，参与程序性坏死调节，而程序性坏死可参与心肌缺血、动脉粥样硬化等多种疾病发生及发展过程，心肌缺血再灌注损伤发生过程中RIPK1 浓度升高，抑制RIPK1表达可显著减少大鼠心肌缺血再灌注损伤［16］。还有研究表明，胎儿生长受限患儿母体胎盘组织中RIPK1 浓度升高，且主要定位于在合胞滋养层细胞以及细胞亚群，因此其推测RIPK1 可能是导致胎盘细胞程序性坏死的主要因素［17］。国外学者通过小鼠实验结果显示，小鼠胚胎成纤维细胞中RIPK1 突 变体D325V 和D325H 不仅增加RIPK1 激活介导的细胞凋亡和坏死性凋亡，同时也会造成促炎细胞因子增多，严重可导致小鼠发育过程中胚胎致死［18］。本研究结果显示，与对照组相比，CHD 组母体血浆中RIPK1 浓度显著升高，可能是RIPK1 调控程序性坏死而诱导炎症细胞增多，造成胎儿生长受限，导致胚胎发育异常，最终造成心脏发育异常。相关性分析显示，CHD 组血浆miR-22-3p 与RIPK1 浓度呈负相关性，表明miR-22-3p、RIPK1 可能存在负向调控关系，共同参与调控心脏发育过程中细胞的凋亡和炎症因子的分泌，导致心脏畸形。

进一步分析显示，NT 厚度、血浆RIPK1、miR-22-3p 联合预测胎儿CHD 的敏感度为89.47%，特异度为85.00%，曲线下面积为0.933，敏感度及曲线下面积均高于NT 厚度及血浆miR-22-3p、RIPK1 单独检测，提示NT 厚度联合血浆miR-22-3p、RIPK1 对胎儿CHD 有一定预测价值，对胎儿心脏病早期筛查具有一定临床应用意义。

综上所述，CHD 胎儿NT 厚度增加，母体血浆中miR-22-3p 浓度降低，RIPK1 浓度升高，超声检测胎儿NT 厚度联合母体血浆miR-22-3p、RIPK1浓度检测对胎儿CHD 具有较高诊断价值，具有一定临床应用意义。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。