辣椒抗逆相关转录因子的研究进展

张 余,章毅颖,任 丽,邓 姗,赵 洪,褚云霞,陈海荣

(上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所,上海 201403;农业农村部植物新品种测试(上海)分中心,上海 201415;上海市设施园艺技术重点实验室,上海 201403)

辣椒(Capsicum spp.L)为茄科辣椒属植物,起源于中南美洲热带及亚热带地区,16世纪传入中国。辣椒具有特殊的辛辣味,早期主要以花椒替代品出现,随着人们对辣椒认识的深入,目前已形成了一条完整的产业链,覆盖食品、医疗、工业等行业[1-2]。辣椒具有比较好的适应性,地理分布十分广泛、品种资源多样性非常丰富。辣椒属有30多个种,其中,一年生辣椒(C.annuumL.)、灌木状辣椒(C.frutescensL.)、中国辣椒(C.chinenseJacq.)、浆果状椒(C.baccatumL.)和绒毛辣椒(C.pubescensKeep.)为5个重要的栽培种[3]。FAO(http:∕∕www.FAO.org)统计数据显示,我国辣椒种植面积为77.16万hm2,产量为1 821.4万t,均居世界首位。

逆境因子分为两类,一类为生物胁迫,另一类为非生物胁迫。辣椒生产过程中的生物胁迫因子主要包括青枯菌、疫霉菌、疫病等,非生物胁迫因子主要包括干旱、盐渍化、高温、低温以及重金属污染等。逆境条件下,植物细胞的受体蛋白感受外界刺激信号,在体内产生小分子类物质,其作为第二信使通过激酶级联反应激活一系列转录因子(Transcriptionfactor,TF),促进逆境应答相关基因的表达,以增强植物对逆境的抗性[4]。目前,植物中已经发现了约64种转录因子家族[5]。本文主要对辣椒AP2∕ERF、WRKY、bZIP、NAC、MYB转录因子家族的分类以及在抗逆过程中的作用进行综述,以期为辣椒抗逆相关分子标记的开发和抗逆育种提供参考。

1 AP2∕ERF转录因子家族

1.1 CaAP2∕ERF转录因子结构特点

AP2∕ERF转录因子家族因其序列含有保守的AP2∕ERF DNA结合结构域而得名,AP2∕ERF家族共分为AP2、ERF、RAV和其他(Soloist)四个亚家族,AP2亚家族含有2个AP2结构域,ERF亚族含有1个AP2结构域,RAV亚家族包含1个AP2结构域和1个B3结构域。ERF亚家族根据保守结构域中第14位和第19位的氨基酸可以进一步分为DREB和ERF亚组[6]。辣椒中存在175个AP2∕ERF转录因子成员,其中29个成员含有2个AP2结构域;CaAP2∕ERF152含有B3保守结构域,属于RAV亚家族;CaAP2∕ERF140与其他ERF具有很低的同源性,归类于Soloist亚家族;其余144个成员序列中仅包含1个AP2结构域,属于ERF亚家族[7]。

1.2 CaAP2∕ERF转录因子参与辣椒抗逆

辣椒AP2∕ERF转录因子家族成员在植物抵抗非生物胁迫和生物胁迫过程中发挥着重要作用。CaERFLP1,ERF亚家族第IV组成员,受青枯病、高盐、乙烯以及机械损伤诱导表达,烟草中过表达CaERFLP1基因,促进了多个与抗病相关基因的表达,这些上调表达基因的启动子区含有AP2∕ERF家族结合的GCC-box保守元件,可进一步提高植株对假单胞杆菌和盐胁迫的抗性[8]。Hong等[9]利用消减杂交技术从干旱胁迫后的辣椒根中分离得到了14个受干旱诱导的cDNA序列,其中CaDREBLP1编码一个DREB亚家族转录因子,该转录因子基因的表达受干旱、高盐诱导。CaERF4基因受茉莉酸甲酯、乙烯、青枯菌以及高温诱导表达[10]。CaERF109基因受低温诱导,而激素赤霉素、生长素、茉莉酸甲酯不能诱导该基因的表达[11]。CaERF5基因受水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯以及青枯菌诱导表达,异源表达CaERF5基因能够促进抗病相关基因以及防御相关基因的表达,增强烟草对青枯病菌的抗性[12]。郑井元等[13]研究发现,CaERF18基因的表达受南方根结线虫诱导表达。表明ERF基因在应答不同逆境胁迫时存在一定的特异性。

CaAIEF1基因受干旱、高盐、ABA诱导表达,异源表达CaAIEF1基因促进逆境相关基因的表达,正向参与干旱和ABA信号途径[14]。辣椒受疫病侵染后CaPT1基因表达上调,VIGS(病毒诱导基因沉默)介导的基因沉默削弱了辣椒对疫病的抗性[15]。Yi等[16]研究表明,CaPF1(Capsicum annuum pathogen and freezing tolerance-related protein1)基因受乙烯、茉莉酸甲酯等激素以及盐、低温、甘露醇等胁迫的诱导表达,异源表达CaPF1能够增强拟南芥对病原菌(P.syringae pv tomatoDC3000)以及冻害(-6℃)的抗性。马铃薯中异源表达CaPF1基因显著提高了其对低温、高温、重金属等非生物逆境因子的抗性。裸子植物弗吉尼亚松(Pinus virginianaMill.)中表达辣椒CaPF1基因增强了其对高温、重金属以及病原菌苏云金芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的抗性[17]。此外,过表达CaPF1基因能够维持北美白松(Pinus strobusL.)体内的多胺水平,增强对高盐、干旱以及冻害的耐受性。综上,辣椒CaPF1基因通过调节植物体内的代谢过程,提高植物在不同逆境下的适应性[18]。

CaERF064受乙烯、水杨酸、茉莉酸诱导表达,瞬时表达CaERF064能够诱导细胞发生程序性死亡,CaERF064基因的沉默抑制了抗病相关基因CaBPR1、CaPO2和CaSAR82的表达,削弱了辣椒对疫病的抗性,过表达CaERF064能够增强烟草对疫病的抗性,表明CaERF064基因在辣椒对疫病应答方面起正调节作用[7,19]。CaRAV1包含一个AP2结构域和B3结构域,黄单孢杆菌侵染后,CaRAV1基因的表达显著上调,拟南芥中异源表达CaRAV1提高了PR相关基因的表达,增强了对假单孢杆菌的抗性,同时转基因过表达植株对干旱和高盐的耐受性也显著增强[20]。CaRAV1蛋白与氧化还原蛋白CaOXR1共定位于细胞核中,并且在体内发生互作,病毒介导CaRAV1或者CaOXR1∕CaRAV1基因的沉默显著削弱了植株耐盐性和渗透胁迫能力,拟南芥中过表达CaRAV1、CaOXR1和CaOXR1∕CaRAV1基因增强了植株对活体营养型卵菌的抗性和非生物胁迫的耐受性,表明辣椒通过CaOXR1∕CaRAV1信号转导途径实现对多种逆境的调节[21]。

2 WRKY转录因子家族

2.1 CaWRKY转录因子结构特点

WRKY转录因子家族保守结构域包含典型的7肽核心序列WRKYGQK,辣椒基因组中存在62个CaWRKY基因,根据WRKY结构域数目和锌指结构的特征,WRKY转录因子家族分为三类:第1类由2个WRKY结构域和C2H2锌指结构域组成,包含13个成员;第2类由1个WRKY结构域和C2H2锌指结构域组成,包含40个成员,根据结构域保守氨基酸的差异进一步分为2a、2b、2c、2d、2e这5个亚类,分别含有4、6、16、6和8个成员;第3类由1个WRKY结构域和C2HC锌指结构域组成,包含9个成员[22]。第二类中的2c亚组,16个成员中的13个包含完整的WRKY保守结构域,而CaWRKY1包含了1个WRKY保守结构域但缺乏锌指motif;CaWRKY58缺乏保守的WRKY核心序列,但包含锌指motif;CaWRKY3包含保守的WRKY结构域,但锌指结构域不是典型的C-X4-C-X23-H-X1-H。尽管CaWRKY12含有不完整的锌指结构,但仍然归类为2d亚组,此外,CaWRKY 39、CaWRKY50、CaWRKY56和CaWRKY62包含非典型的WRKYGKK多肽,CaWRKY17包含WRKYGMK,CaWRKY51包含WRKYGHK多肽[23]。

2.2 CaWRKY转录因子参与辣椒抗逆

王倩倩等[24]研究表明,CaWRKY14基因受ABA、高温、高盐、干旱以及疫霉菌诱导表达,CaWRKY14基因沉默后削弱了辣椒植株对疫霉菌的抗性。CaWRKY8和CaWRKY13基因的表达受高温和高盐诱导表达,此外CaWRKY8还受疫霉菌及干旱诱导表达,而CaWRKY13受低温诱导表达[25-26]。刘志钦等[27]研究发现,辣椒CaWRKY5基因启动子-886—489位置存在应答青枯菌侵染的作用元件。CaWRKY2受辣椒轻斑驳病毒、黄单胞菌、ETH、SA、MeJA和机械损伤诱导表达[28]。辣椒青枯菌、疫病、烟草花叶病毒均能够诱导CaWRKY30基因的表达,有毒性的根结线虫侵染和MeJA处理后CaWRKY30基因表达受到了明显抑制[29]。

干旱和高盐胁迫条件下,异源表达CaWRKY27基因导致了体内ABA合成、ROS解毒以及多胺合成相关基因下调表达,植株的抗逆性减弱,而CaWRKY27基因的沉默植株则表现出相反的结果[30]。外源SA、ETH、MeJA以及青枯菌能够诱导CaWRKY27基因的表达,烟草中异源表达CaWRKY27基因显著提高了其对青枯菌的抗性,沉默该基因则表现出相反的表型[31]。过表达CaWRKY20基因促进抗逆相关基因CaNPR1、CaDEF1、CaACO、CaHsfA2和CaHSP24的表达,沉默CaWRKY20基因,辣椒植株对青枯病的抗性显著降低,异源表达CaWRKY20基因,烟草对青枯病的抗性显著提高[32]。CaWRKY58编码一个I型WRKY转录因子,在辣椒调节青枯菌侵染过程中发挥负向作用[33]。

CaWRKY40基因的表达受JA、SA、ETH、高温高湿和青枯菌的诱导,异源表达CaWRKY40基因显著提高烟草对青枯菌以及高温的耐受性,而辣椒CaWRKY40基因的沉默削弱了植株对青枯菌以及高温的抗性[34]。CaWRKY22基因的表达受多种激素以及青枯菌的诱导,直接参与CaPR1、CaDEF1、CaWRKY40等基因的调节,与CaWRKY40之间表现出反馈调节关系,此外,CaWRKY22还与CaWRKY6、CaWRKY27和CaWRKY58存在复杂的调控关系[35]。CaWRKY6基因的表达受高温、高湿、青枯菌、JA、ETH以及ABA的诱导表达,能够结合CaWRKY40基因启动子区的W-box(TTGACCY)元件[36]。何水林等[36-37]通过对CaWRKY40转录因子作用的靶基因进行筛选,获得了一批直接受CaWRKY40调节的基因,如CaC3H14、CaHIR1、CaPO2、CaDEF1、CabZIP53等,由此推断辣椒CaWRKY40基因在调节青枯菌侵染的信号途径方面发挥关键作用。CaWRKY71与CaWRKY40二者相互作用,沉默CaWRKY71基因导致抗病相关基因CaPR1、CaNPR1、CaDEF1、CaABR1等表达下调,增强了辣椒对青枯菌的敏感性[38]。CaWRKY3基因在应答青枯菌侵染过程中起负调节作用[39]。黄雪盈等[40]研究发现,CaWRKY40b与CaWRKY40同源,青枯菌侵染后其表达水平发生显著下调,CaWRKY40b基因沉默植株对青枯菌的抗性显著减弱;过表达CaWRKY40b-SRDX后(SRDX起嵌合阻遏作用)表现出相同的结果[41]。此外,CaWRKY40与CaCDPK15在转录水平上反馈调节辣椒对青枯菌的抗性[42]。根结线虫是辣椒的主要病害之一,目前辣椒生产中根结线虫抗性品种相对较少,郑井元[43]通过转录组数据获得了2个应答根结线虫入侵的WRKY基因CaWRKY6和CaWRKY30,转基因试验证明CaWRKY30基因在应答根结线虫入侵过程中起负向调节作用,而CaWRKY6在应答根结线虫入侵中的作用不显著。

3 bZIP转录因子家族

3.1 CabZIP转录因子结构特点

bZIP转录因子是由其保守的碱性亮氨酸拉链结构域来命名,核心保守结构域由基本区(basic region)和ZIP区组成,其中基本区含有结合DNA的N-x7-R∕K以及一个NLS(核定位信号),ZIP区由亮氨酸的七肽重复结构(L-X6-L-X6)组成。bZIP转录因子家族可以结合A-box(TACGTA)、T-box(AACGTT)、C-box(GACGTC)、G-box(CACGTG)以及Gcn4(G∕CTCA)顺式作用元件。魏瑞敏等[44]将辣椒bZIP分为10个组,分布于辣椒11条染色体,含54个基因,分别具有0—11个内含子。Gai等[45]在辣椒品种‘Zunla-1’和‘CM334’中分别筛选到了59个、55个完整的bZIP基因。

3.2 CabZIP转录因子参与辣椒抗逆

在干旱胁迫或者外源ABA处理条件下,马铃薯中异源表达辣椒bZIP转录因子CaBZ1基因,可促进植株体内抗逆相关基因CYP707A1、CBF、NAC-like的表达,导致气孔导度、叶片失水速率、叶绿素含量显著降低,产量显著增加[46]。烟草中瞬时表达CabZIP1,可通过结合CaPR-1基因启动子区的G-box促进PR-1基因表达,参与辣椒抗病相关途径的调节[47]。CaDILZ1(Capsicum annuum Drought-Induced Leucine Zipper1),属于bZIP家族D组成员,该基因的表达受ABA、干旱、高盐诱导,与CaDSR1调控网络共同参与辣椒抗旱过程[48]。CaASRF(Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3ligase1),编码一个泛素连接酶,通过调节bZIP转录因子CaAIBZ1和CaAIBZ1的稳定性正向调节植物的抗旱性,表明这两个CabZIPs转录因子在调节植物抗旱过程中发挥负调节作用[49-51]。

烟草中异源表达CabZIP1可以提高烟草耐盐能力,但对青枯菌表现敏感,辣椒中CabZIP1基因的沉默导致植株对盐胁迫的敏感性增强而对青枯菌的抗性显著增强,此外过表达植株对ABA的敏感性显著减弱[52]。CabZIP53为CaWRKY40转录因子的靶蛋白,青枯菌侵染诱导CabZIP53基因的表达,VIGS介导的CabZIP53基因沉默植株在青枯菌侵染后,其体内CaPR1、CaNPR1和CaHIR1等抗病相关基因发生下调,削弱了辣椒对青枯菌的抗性[53]。青枯菌和高温高湿环境能够诱导CabZIP63基因的表达,该基因通过结合自身以及CaWRKY40启动子区的C-box或者G-box参与调节其表达水平,沉默CabZIP63基因导致免疫以及高温相关基因的表达发生下调[54]。

Lee等[55]从黄单胞杆菌侵染后的辣椒材料中克隆了一个bZIP转录因子CAbZIP1基因,异源表达该基因显著提高了拟南芥抵抗丁香假单胞菌(Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000)侵染能力,同时增强了植株抗旱、耐盐以及抗氧化的能力。VIGS介导的CabZIP2基因沉默降低了与防御相关的基因CaBPR1和CaAMP1的表达,增强了植株对黄单孢杆菌的敏感性,而过表达植株则表现出相反的表型[56]。Lee等[57]分离出辣椒轻斑驳病毒相关基因PPI1(pepper-PMMV interaction1),该基因属于bZIP转录因子家族成员,其表达受不亲和轻斑驳病毒及黄单孢杆菌诱导,非生物胁迫SA、MeJA、ABA和H2O2不影响其表达,暗示着PPI1基因仅在防御方面发挥作用。

4 NAC转录因子家族

4.1 CaNAC转录因子结构特点及分类

NAC转录因子家族为植物所特有,该转录因子家族序列的N端包含一个高度保守的DNA结合结构域和C端可变的激活结构域,N端结构域进一步可以分为5个亚结构域,根据结构域和亚结构域,NAC转录因子家族被分为两组,I组和II组,这两组可以进一步分为14个和4个亚组[58]。Diao等[59]通过全基因组测序发现104个NAC转录因子,这些转录因子主要集中在1、2、4、6号染色体上,共分为3组:I组中含有63个成员;II组中含10个成员;III组为茄科所特有,含有24个成员。CaNACs拥有0—8个内含子,其中含2个以内的内含子数量的转录因子占到了78.9%(为83个)。

4.2 CaNAC转录因子参与辣椒抗逆

目前关于辣椒NAC转录因子在抗逆方面的研究较少,CaNAC45基因的表达受干旱、高盐、ABA、SA、MeJA胁迫诱导[60]。Oh等[61]发现,CaNAC1通过不兼容的过敏性细胞坏死来提高植物对非寄主病原菌和病毒的防御反应。刁卫平等[62]通过转录组鉴定到了21个应答疫霉菌侵染的NAC转录因子基因,其中18个属于Group1、3个属于Group2,暗示NACs参与辣椒对疫霉菌侵染的应答。

CaNAC72基因的表达受多种植物激素、非生物逆境以及青枯菌的诱导表达,烟草中异源表达CaNAC72基因显著提高了植株对盐胁迫的抗性,但对青枯菌的抗性显著下降,暗示CaNAC72在参与调节逆境方面发挥双重作用[63]。CaNAC35基因的表达受多种非生物逆境因子以及激素的诱导表达,CaNAC35基因沉默的植株在低温、高盐和渗透胁迫下抗性显著降低,过表达转基因植株则表现出相反的表型[64]。CaNAC2基因受低温、高盐、ABA诱导,此外渗透胁迫和水杨酸抑制了CaNAC2的表达,基因沉默增强了其对冷胁迫的敏感性,但延缓了盐胁迫下叶绿素的降解[65]。CaNAC36基因受乙烯、茉莉酸甲酯诱导表达,甘露醇、高盐以及水杨酸能够抑制其表达;烟草中表达CaNAC36显著削弱了其对青枯菌以及盐分的抗性[66]。Hou等[67]研究表明,CaNAC064基因正向调节辣椒对低温的抗性。NAC转录因子CaBtf3(B transcription factor3)基因抑制了HR反应相关基因的表达,导致对Tobacco mosaic virus(TMV)-P0病原菌的抗性减弱,烟草中沉默CaBtf3的同源基因NtBtf3表现出相似的结果[68]。

5 MYB转录因子家族

5.1 CaMYB转录因子结构特点

MYB转录因子序列中均含有一个高度保守的MYB保守结构域,该结构域通常由0—4个不完全氨基酸序列重复(R)组成,每个重复区(R)包含约52个氨基酸,根据重复区(R)的数量,拟南芥中的MYB转录因子家族分为1R、2R、3R、4R共4个亚组[69]。居利香等[70]利用生物信息学方法从辣椒基因组中筛选到172个MYB转录因子,1R、2R、3R、4R亚组中分别含有61、105、5个和0个,此外,6R亚组为辣椒所特有。转录因子基因分布于辣椒的12条染色体上,绝大部分分布于染色体的末端,尚有14个MYB基因的染色体定位信息不清楚。此外,MYB基因含有0—5个内含子,其中含有2个内含子的基因数目占比47%。

5.2 CaMYB转录因子参与辣椒抗逆

MYB转录因子家族基因在花青素、果实生长发育、品质等方面的调控作用比较多,而花青素与植物的品质和抗逆性密切相关[71]。辣椒R2R3类型的转录因子CaMYB基因受多种胁迫处理表达,如高盐、低温、干旱、ABA等[72]。CaPHL8基因沉默后,与防御相关的标记基因的转录水平降低,植株对青枯菌的免疫力降低,生长受到抑制,表明CaPHL8基因正向调节辣椒对青枯菌的抗性[73]。Mishra等[74]发现1个MYB转录因子基因CaMYB在高抗材料中的表达水平极显著高于敏感材料。以上结果均表明,辣椒MYB转录因子家族在应答逆境胁迫方面也发挥着重要作用。

6 展望

转录因子家族基因在不同植物中往往在功能上存在相关性,如拟南芥和水稻中bZIP转录因子家族中的A组成员参与ABA信号途径,调节气孔开闭以及种子萌发等过程,辣椒bZIP转录因子家族中的A组成员可能也具有相似的功能。不同转录因子(家族)在同一胁迫下可能发挥相同作用,这些转录因子间的调控存在着复杂的交叉作用,如Hwang等[75]从辣椒中分离出317个受冷胁迫相关的基因,包括AP2∕ERF、WRKY、bZIP等转录因子家族的基因。申磊[76]通过ChIP试验揭示了CabZIP63能够结合CaWRKY40基因的启动子区,参与CaWRKY40应答的青枯菌以及高温途径;CabZIP、CaMYB、CaWRKY等基因同时参与对炭疽病的应答;AP2转录因子CaPF1参与冻害和病原菌胁迫途径[16-18,74]。此外,茄科或者辣椒所特有的转录因子参与的调控途径可能为种属所特有[77-78]。

尽管辣椒中多个转录因子被鉴定,然而大多数仅在表达层面作出了分析,关于转录因子在逆境中的功能研究相对有限,近年来植物转基因技术发展非常迅速,研究者们对辣椒的遗传转化也做了非常多的探索性工作,成功诱导出愈伤组织并分化出叶片,但很少能分化出根,这在很大程度上限制了辣椒基因功能的研究与利用。未来突破辣椒转基因技术以及抗逆相关基因的挖掘和鉴定,对于改良辣椒品种、培育抗逆性强的辣椒品种具有重要意义。