环状RNA m6A 甲基化修饰在口腔疾病中的研究进展

杨靖雯， 周海文

上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔黏膜病科，上海交通大学口腔医学院，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海（200011）

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一种新型非编码RNA，1976 年circRNA 在植物病毒中被首次发现，描述为“共价闭合的单链环状RNA 分子”，起初被认为是RNA 异常剪接的副产物［1］。随着RNA测序技术和生物信息学的发展，研究发现circRNA在生物的发生发展过程中发挥了重要作用：miRNA 海绵功能、调节可变剪接以及调节基因表达［2］。现已发现circRNA 在癌症的发生、发展和耐药性中起着至关重要的作用，且circRNA 在外泌体和人体体液中含量丰富，可通过细胞间通讯对肿瘤微环境产生影响［3］。circRNA 主要由外显子环化形成，广泛稳定存在于生物体内，在基因表达调控中发挥重要作用，可作为疾病的生物标志物，在临床诊断和治疗方面有广阔的应用前景。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰是发生在碱基腺嘌呤（A）第六位N 原子上的甲基化，主要发生在RRACH 序列中的A 上。近年研究发现，m6A 甲基化修饰circRNA 在人胚胎干细胞中显示出特异性甲基化模式，m6A 修饰可促进circRNA 降解、核输出，并对circRNA 翻译有调控作用［4］。本文就circRNA m6A 甲基化修饰在机体生理过程、恶性肿瘤及口腔疾病中的研究现状作一综述。

1 m6A 修饰概述

m6A 甲基化修饰是一个动态且可逆的过程，这种修饰由3 种调节蛋白控制，分别是甲基转移酶、去甲基化酶和阅读蛋白。①甲基转移酶促使RNA m6A 甲基化，甲基转移酶样蛋白3/14（methyltransferase-like 3/14，METTL3/14）可形成复合物使RNA m6A 甲 基 化，Wilmstunwell binding 蛋 白 辅 助METTL3/14 定位并维持体内m6A 甲基转移酶的催化活性［5］，此外，RNA 结合基序蛋白15/15B（RNAbindingmotifprotein 15/15B，RBM15/15B）和类病毒m6A 甲基转移酶（vir-like m6A methyltransferase associated，VIRMA）在调节METTL3 和METTL14 活动中发挥重要作用［6］；②去甲基化酶执行RNA 去甲基化功能，肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）和alkB 同 源 物5（demethylated by human AlkB homolog H5，ALKBH5）一起维持转录组中m6A 水平的平衡［7-8］；③阅读蛋白可识别m6A 位点并结合甲基化RNA，其中最突出的是含有YTH 结构域的RNA 结合蛋白，在细胞质中特异性识别m6A 修饰的mRNA，能与m6A RRACH 片段重叠以介导RNA 特异性结合［9］，此外，阅读蛋白还包括异质核核糖核蛋白（eterogeneous nuclear ribonucleoproteins，HNRNP）家族（HNRNPC/HNRNPG/HNRNPL/HNRNPA2B1）［10］、胰岛素样生长因子2 结合蛋白家族（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins，IGF2BP1/2/3）及PRRC2A。

2 m6A 修饰对circRNA 的调控作用

2.1 m6A 修饰调节circRNA 翻译

Yang 等［11］发现m6A 基序通过募集YTH m6A RNA 结合蛋白1（YTH m6A RNA binding protein 1，YTHDF1）和翻译起始因子eIF4G2/eIF3A 启动并诱导circRNA 翻译，且数百种的内源性circRNA 具有翻译潜力。近期研究表明，m6A 修饰可通过YTHDF3 和eIF4G2 的识别调节circRNA 翻译［12］。

2.2 m6A 修饰促进circRNA 的核输出

Chen 等［13］首次发现m6A 修饰会促进circRNA的核输出：YTHDC1 可与源自NOP2/Sun 结构域家族成员2（NOP2/Sun domain family member 2，NSUN2）的circNSUN2 结合，促进circNSUN2 以m6A 依赖性方式从细胞核输出到细胞质。此外有研究发现，Hel25E 的同源蛋白UAP56 和URH49 可介导不同长度的circRNA 的出核，然而两者对circRNA 长度测量的详细机制仍不清楚［14］。

2.3 m6A 修 饰 促 进circRNA 降 解

由于封闭的环状结构，circRNA 不易被水解，往往比其亲本线性RNA 更稳定。m6A 甲基化修饰的circRNA 依赖热反应蛋白-12（heat-responsive protein 12，HRSP12）与YTHDF2 结合，通过核糖核酸内切酶切割选择性降解circRNA［15］。

3 circRNA m6A 甲基化修饰在机体生理过程中的作用

3.1 免疫系统

研究表明m6A 甲基化修饰可调控免疫反应，circRNA 为封闭的环状结构，能逃离末端监控系统。研究发现，机体通过YTHDF2 识别m6A 以辨认“自身”circRNA，抑制RIG-I 激活从而抑制先天免 疫［16］。 此 外，源 自NDUFB2 的circNDUFB2（hsa_circ_0007518）可触发非小细胞肺癌细胞的免疫防御反应，通过RIG-I 识别以激活RIG-I-MAVS信号级联，将免疫细胞募集到肿瘤微环境中［17］。

3.2 生殖系统

在雌性生殖系统中，METTL14 介导的m6A 甲基化修饰改变了circGFRα1 向细胞质的输出，circ-GFRα1 通过充当竞争性内源性RNA 促进雌性生殖系干细胞自我更新，吸附miR-449，增强GFRα1表达和激活胶质细胞衍生神经营养因子信号通路［18］。另有研究发现，在雄性生殖细胞中，ALKBH5 和METTL3 通过调节m6A 水平影响circRNA生物合成，circRNA 在减数分裂晚期和早期单倍体雄性生殖细胞中积累并发挥作用，持续供应对晚期精子发生和正常精子功能至关重要的蛋白质［19］。

3.3 肌细胞

随着成肌细胞发育分化，eIF4G2 和m6A 阅读蛋白YTHDF3 的mRNA 相对表达水平增加，m6A 可驱动circRNA 翻译，并预测骨骼肌C2C12 成肌细胞分化过程中差异表达的circRNA 的功能和编码潜力［20］。在高糖处理的血管平滑肌细胞中发现circYTHDC2 的稳定受YTHDC2 介导的m6A 修饰正向调节，而circYTHDC2上调可由血管平滑肌细胞中的高葡萄糖刺激诱导，敲除circYTHDC2 可抑制血管平滑肌细胞的增殖和侵袭并阻止细胞周期进程［21］。

4 circRNA m6A 甲基化修饰在恶性肿瘤中的作用

此前，m6A 甲基化修饰的研究仅局限于mRNA水平，直至2017 年Yang 等［11］报道了由m6A 甲基化驱动的广泛翻译，首次探索了m6A 修饰对circRNA的调控作用，为circRNA 水平的m6A 修饰研究开启了新篇章。该研究发现circRNA 含有大量共有m6A 基序，且在翻译起始因子eIF4G2 和m6A 阅读蛋白YTHDF3 介导单个m6A 位点驱动翻译起始，并被甲基转移酶METTL3/14 增强，被去甲基酶FTO 抑制。研究发现circRNA m6A 修饰在结直肠癌［22］和肝癌［23］发生发展中也具有重要调控作用，m6A 修饰诱导circ1662 剪接与表达可加速YES 关联蛋白1 重组蛋白核转运，从而促进结直肠癌细胞侵袭和迁移；hsa_circ_0007456 通过与hsa-miR-139-5p 结合促进YTHDF1 表达，从而促进HCC 细胞增殖。值得注意的是，Chen 等［13］在结直肠癌肝转移中发现了m6A 甲基化可促进circRNA 的核输出，circNSUN2 通过YTHDC1 与IGF2BP2 从细胞核输出到细胞质，增强下游靶基因HMGA2 的mRNA 稳定性，促进结直肠癌细胞侵袭性，此研究结果为结直肠癌提供了一个潜在的治疗靶点circNSUN2。近年来研究发现circRNA m6A 修饰还在宫颈癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、下咽鳞癌、肺动脉高压和胃癌等恶性肿瘤的发生和进展中发挥重要调控作用［24］。

5 circRNA m6A 甲基化修饰在口腔领域的研究现状

目前，circRNA 水平的m6A 甲基化修饰在口腔方向的文献极少，研究仅限于在成釉细胞瘤和口腔种植骨吸收方向初步研究。Niu 等［25］首次提供了人类成釉细胞瘤的m6A 修饰表达谱全景观，认为m6A 修饰影响长链非编码RNA 和circRNA 的加工，并鉴定了具有高甲基化或低甲基化m6A 修饰的差异表达的mRNA，这可能有助于观察m6A 介导的基因表达调控机制。在口腔种植方向，RNA 甲基化酶METTL3 作用于成骨细胞外泌体中circ_0008542 的m6A 功 能 位 点，促 进circ_0008542 与miRNA-185-5p 的竞争结合，导致靶基因RANK（receptor activator of NF-kB）的增加和破骨细胞骨吸收的启动；而RNA 去甲基化酶ALKBH5 抑制circ_0008542 与miRNA-185-5p 的结合，从而纠正骨吸收过程，提示可使用释放ALKBH5 的外泌体增强即刻种植体的抵抗力［26］。

此外，口腔扁平苔藓组织异常表达的circRNAs表达谱已构建，表明circRNA 在OLP 的发病机制中发挥了重要作用［27］。Xu 等［28］发现circRNA 在口腔潜在恶性疾病——口腔白斑（oral leukoplakia，OLK）中发挥重要作用，构建了OLK circRNA 表达谱并对OLK 中的差异circRNA 进行了全面的生物信息学分析，源于人白细胞抗原-C（human leukocyte antigen-C，HLA-C）的circHLA-C 是一种很有前景的诊断生物标志物，具有作为OLK 治疗性遗传靶点的潜力；Hsa_circ_0060927 可作为潜在的关键ceRNA，通过上调三结构域蛋白14（tripartite motifcontaining 14，TRIM14）海绵下游miR-195-5p 并促进OLK 癌变，Hsa_circ_0060927 有望成为通过hsa_circ_0060927/miR-195-5p/TRIM14 轴预防和治疗OLK 致癌的分子标志物［29］。但circRNA 水平的m6A 甲基化修饰在口腔恶性及潜在恶性疾病方向的研究仍较少。

m6A 修饰与OSCC 的发生发展密切相关，其中研究最多的是m6A 甲基转移酶METTL3 与METTL14 在OSCC 中的作用，但关于circRNA 的m6A 修饰在OSCC 及口腔潜在恶性疾病中的研究未见报道，因此笔者仅从m6A 相关酶在OSCC 中的研究阐述m6A 甲基化修饰在OSCC 中的研究现状。①METTL3 是调节OSCC 肿瘤发生的关键因素，通过YTHDF1 介导的m6A 修饰增强c-Myc 稳定性，促进OSCC 发 生［30］；METTL3 介 导 的m6A 修 饰 促 进BMI1 mRNA 翻译并增强OSCC 的增殖和转移［31］；METTL3 还可通过m6A 介导阅读蛋白IGF2BP2 结合 增 强SLC7A11 的mRNA 稳 定 性，促 进OSCC 进展［32］；此外，当OSCC 细胞自噬被激活时，METTL14的表达上调，METTL14 的高表达可有效降低OSCC的增殖、迁移和侵袭［33］。②m6A 去甲基化酶FTO可靶向作用于OSCC 中的eIF4G1 转录本并调节细胞自噬和肿瘤发生；在雷帕霉素诱导的OSCC 自噬细胞中发现，敲低FTO 表达后导致eIF4G1 下调，同时促进自噬并抑制肿瘤发生［34］；FTO 在有咀嚼槟榔习惯的OSCC 患者黏膜组织和慢性槟榔碱处理的OSCC 细胞系中上调，且FTO 在OSCC 细胞中受到FOXA2 转录因子负调控，表明FTO 在槟榔碱诱导的OSCC 进展中发挥致癌作用［35］；③m6A 阅读蛋白HNRNPL 可调节OSCC 组织中SRSF3 的表达和SRSF3 外显子的可变剪接［36］，研究表明HNRNPC 可促进OSCC 的癌变，可能成为OSCC 新的生物标志物和治疗靶点［37］；沉默HNRNPA2B1 可通过上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）抑制OSCC 的增殖、迁移和侵袭，HNRNPA2B1 可能具有通过LINE-1/TGF-β1/Smad2/Slug 信号通路靶向EMT 促进OSCC 癌变的潜力［38］。

6 小 结

综上所述，circRNA m6A 修饰在多种良恶性疾病中发挥重要临床价值，但在口腔领域仅处于初步探索阶段。circRNA m6A 修饰在口腔恶性疾病和潜在恶性疾病中的作用有广阔的研究前景，深入探索circRNA m6A 修饰在口腔疾病中的调控机制，为口腔恶性疾病及口腔潜在恶性疾病的诊断与治疗提供参考。

【Author contributions】Yang JW wrote the article. Zhou HW revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.