调节性T细胞介导的免疫检查点抑制剂获得性耐药机制研究进展①

袁文丽 邓德耀（云南大学附属医院，云南省第二人民医院，云南省眼科医院检验科，昆明 650021）

免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibi‐tors，ICIs）在肿瘤免疫治疗中的应用越来越广泛，ICIs具有广谱的抗肿瘤效应、治疗肿瘤精准化、适用症不断扩大等特点［1-2］。然而，与肿瘤靶向治疗一样，ICIs治疗也不可避免地出现耐药［3-4］。获得性耐药的产生是ICIs治疗失败和肿瘤复发的重要原因。近年，研究结果显示调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）可能参与了ICIs的获得性耐药［5-6］。Treg是CD4+T细胞的免疫抑制子集，通过抑制T效应细胞（effective T cell，Teff）促进肿瘤的进展。本文就Treg生长发育、生物功能特性、介导ICI获得性耐药机制以及治疗策略进行综述，为克服ICIs抗药性研究提供理论依据。

1 Treg的免疫学分类

目前已经发现的Treg亚群有多种，其中研究较多的是CD4+CD25+Treg。由于其在免疫调节中的重要作用，文献中Treg多特指CD4+CD25+Treg。Treg可分为天然型Treg（nTreg）和诱导型Treg（iTreg）。其中，nTreg是由胸腺产生的，在外周血中受TGF-β调节维持其活性；iTreg是由幼稚的CD4+T细胞的前体细胞诱导而成，是静息T细胞在TGF-β、IL-10、IFN-α，或低剂量抗原诱导下分化而成。

根据T细胞标记CD45RA、CD25和FOXP3的表达水平，人类FOXP3+CD25+CD4+T细胞可分为3类（表1）：原始Treg（CD45RA+FOXP3loCD25loCD4+）、效应Treg（eTreg）（CD45RA−FOXP3hiCD25hiCD4+）和 非Treg（CD45RA−FOXP3loCD25loCD4+）。原始的Treg是从胸腺中分离出来的细胞，但尚未在周围被激活，免疫抑制活性较弱。在T细胞受体（T cell receptor，TCR）刺激下，原始Treg迅速增殖，分化为高度免疫抑制的效应Treg。相比之下，FOXP3+非Treg不是免疫抑制细胞，而是免疫刺激细胞，并产生炎症细胞因子，如IFN-γ和IL-17。正常情况下，Treg数量较少（占CD4+T细胞的5%~10%），并在维持体内免疫系统平衡中发挥重要作用。在绝大多数肿瘤中，脂肪酸代谢及CCL22等趋化因子等作用下的Treg募集，伴随着TGF-β等细胞因子诱导下Treg的分化，使Treg的数量大大增加［7］。肿瘤微环境中的Treg通过分泌IL-10、IL-2或细胞毒性作用介导Teff的死亡。另一方面，Treg还能通过共抑制信号或CD39、Nrp-1分子，抑制抗原提呈细胞（antigen presentation cell，APC）的成熟及抗原提呈能力，进而发挥其肿瘤免疫逃逸作用。

2 免疫检查点及其抑制剂对Treg的影响

2.1 程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）/细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）CTLA-4和PD-1的表达与不同癌症患者的总生存率呈负相关，在Treg表面组成性表达，并在Teff上诱导激活［1-2］。PD-1广泛表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、肥大细胞和髓样树突状细胞，与局限于APC表面CTLA-4配体不同，其配体程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）广泛表达于肿瘤细胞、免疫细胞、非淋巴和非造血细胞。已有大量的研究证实PD-1、CTLA-4通过不同机制在T细胞活化过程中发挥重要作用［8］。Treg上的CTLA-4与APCs上的B7配体（B7-1和B7-2，又称CD80和CD86）结合，且比T细胞上的CD28亲和力更强。诱导了一个抑制T细胞启动的信号（启动期），CTLA-4A通过与B7形成复合物发生Treg内化，导致APCs-B7表达下调。此外，Treg上的CTLA-4A-B7复合体通过调控APCs抑制Teff的增殖和活化，促进Treg扩增。与CTLA-4相同的是，PD-1抑制Teffs在肿瘤部位（效应期）内增殖和活化。PD-1在Treg上的功能尚不清楚，但是，证据表明PD-1通过增加FOXP3表达以提高Treg的稳定性［9］。

2.2 ICIs选择性抑制Treg单克隆CTLA-4抗体对肿瘤微环境中的CTLA-4+Treg细胞有耗竭作用，但这种耗竭是具有选择性的，可能与依赖来自于巨噬细胞表面受体FcγRⅣ有关。SELBY等［10］发现在CT26和MC38荷瘤小鼠（结肠癌模型）中靶向CTLA-4治疗会选择性耗竭肿瘤内Treg，而不影响血液和继发性淋巴器官中Treg数量，这种现象可能与肿瘤微环境中的Treg CTLA-4表达水平高于其他组织有关。KAVANAGH等［11］的研究则认为CTLA-4 mAb治疗不会影响前列腺癌患者循环Treg细胞的数量，而是增加了激活的Teff的数量。

PD-1抗体与CTLA-4 mAb一样，其介导的抗肿瘤免疫应答也与肿瘤内Teff/Treg比例提高和Teff功能增强相关。但PD-1 mAb作用机制与CTLA-4 mAb不同。当PD-1与PD-L1结合后，通过去磷酸化TCR信号通路，从而抑制Teff的增殖和活化。PD-1/PD-L1可能通过Notch信号通路、天冬酰胺基内肽酶途径影响Treg增殖和抑制表型［12-13］。目前，PD-1在外周血Treg中的作用存在争议。研究显示，PD-1 mAb能够增加黑色素瘤患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中Teff的增殖活化以及下调Treg中的FOXP3表达，并认为PD-1治疗可能对Treg有影响［14］。但是另一项乳腺癌的研究显示：PD-1 mAb治疗对乳腺癌患者PBMC中FOXP3+Treg没有影响［15］。在肿瘤微环境中，RIBAS等［16］观察到抗PD-1治疗并不影响肿瘤微环境内Treg的数量，而是增加CD8+细胞毒性T细胞反应性，并增强其在肿瘤中的积累。也有研究认为，PD-1抗体通过mTOR、MAPK及STAT1信号通路抑制Tregs细胞的诱导分化［17］。与之相反，有研究表明PD-1mAb治疗增加Treg细胞的增殖能力，同时还促进Treg介导的肿瘤免疫抑制作用［18］。

3 Treg介导的ICIs获得性耐药机制

在临床应用ICIs治疗癌症过程中，有限的治疗响应性（优势人群）和获得性耐药是ICIs治疗的两大挑战。ICIs治疗优势人群的筛选可能多涉及肿瘤固有耐药（原发性耐药）范畴；获得性耐药往往发生在肿瘤治疗中，由于肿瘤微环境中出现了代偿途径以逃避ICIs诱导的抗肿瘤反应，这可能是肿瘤内在因素的结果，如肿瘤细胞上免疫调节分子的表达改变，或肿瘤微环境内的细胞因子/生长因子/趋化因子环境、肿瘤浸润免疫细胞分子表达、肿瘤浸润淋巴细胞组成等外源性因素（图1）。

图1 Tregs介导的ICIs获得性耐药机制［5］Fig.1 Tregs-mediated acquired resistance to ICIs［5］

3.1 Treg其他检查点的表达升高抑制Teff活化除CTLA-4和PD-1外，肿瘤微环境内的Treg其他免疫检查点/共抑制受体，如细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（T cell immunoglobulin and mucin domain 3，TIM-3）、淋巴细胞活化基因-3（lymphocyte-activation gene 3，LAG-3）、含Ig及ITIM结构域的T细胞免疫受体（T cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domains，TIGIT）和T细胞活化的V区免疫球蛋白抑制剂（V-domain immunoglobulin suppressor of T cell activation，VISTA），在ICIs治疗后表现出代偿性表达上调。Treg上这些分子的上调水平阻断了Teff的激活，增加Tregs积累并促发肿瘤。

3.1.1 TIM-3 TIM-3最初认为是由CD4+IFN-γ−Th1细胞选择性表达，且其作用仅限于调节Teff功能和细胞因子的产生，近年来，在肺癌、宫颈癌、卵巢肝癌、结肠癌和小鼠肿瘤组织中均检测到大量TIM-3+Treg。此外，从黑色素瘤和结肠癌小鼠模型的肿瘤组织中释放的IL-10、颗粒酶和穿孔素的水平结果可得出，TIM-3+Tregs比TIM-3−Tregs显示出更强的抑制活性。OWEIDA等［19］研究发现，TIM-3分子在CD8+T细胞和Treg中补偿性上调以对抗PD-L1 mAb联合放疗的治疗，并导致肿瘤复发、降低头颈部生存率；抗TIM-3和抗PD-L1联合治疗可以增加CD8+T/Treg比率，并延迟肿瘤生长。以上研究表明TIM-3+Tregs高表达参与了肿瘤的复发和进展，从而对抗PD-1/PD-L1治疗产生耐药性。

3.1.2 LAG-3免疫检查点LAG-3广泛表达于活化的Treg、Teff、B淋巴细胞、NK细胞和树突状细胞表面，以高于CD4的亲和力与APC上的MHCⅡ结合，引起抗原特异性CD4+Teff反应和细胞因子的表达下调。有研究表明，LAG-3还有另一种配体，即肿瘤细胞表达半乳凝素-3（galectin-3），两者结合后通过抑制细胞毒性T细胞的活化来消除肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫［20］。LAG-3+Treg表现出更强的增殖和免疫逃逸能力，而抗PD-1治疗能够上调CD4+T细胞表面LAG-3的表达，这或许是乳腺癌对PD-1抗体治疗获得性耐药的一个原因［21］。

3.1.3 TIGIT TIGIT在活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、Tregs和NK细胞表面表达。TIGIT在T细胞表面与CD226竞争，在树突状细胞表面与CD112和CD155配体竞争，导致Teff激活受到抑制。ZHANG等［22］研究发现，抗TIGIT治疗可以促进PD-1抗体的抗肿瘤效应，这也提示，Treg表面TIGIT的表达上调可能与ICIs的耐药有关。

3.1.4 VISTA VISTA属 于CD28-B7家 族，在Tregs、Teffs、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞表面表达。VISTA与其配体V-Set和VSIG-3结合，阻止Teff增殖，并降低其细胞因子的释放，同时还作用于幼稚T细胞并诱导其分化为Treg。阻断VISTA可以增强Teff在小鼠肿瘤中的聚集和激活，减少Treg和髓系源性抑制细胞数目，从而诱导抗肿瘤免疫应答。与上述分子一样，PD-1抗体治疗也会引起VISTA+T细胞的表达上调，进而参与ICIs治疗的获得性耐药［23］。

3.2 Treg诱导的TGF-β的激活和产生Treg诱导的TGF-β激活（膜结合形式）和可溶性形式的释放可能是Treg促进肿瘤生长/进展和抑制抗肿瘤免疫反应的一个机制。肿瘤微环境中，免疫抑制性肿瘤内Treg细胞的特点是分泌高水平的TGF-β。TGF-β反过来又是诱导FOXP3表达、Treg分化和稳定性以及Treg抑制活性的关键因子，同时，TGF-β还能抑制肿瘤微环境CD8+淋巴细胞的浸润［24］。另一方面，ICI治疗还能激活肿瘤细胞TGF-β/Smad3信号通路［25］。简而言之，Treg诱导的TGF-β的激活和产生可能参与了ICIs治疗的获得性耐药。

3.3 其他ICIs治疗使肿瘤微环境中Treg细胞发生凋亡，而凋亡的Treg细胞则通过腺苷代谢途径，进一步增加自身的肿瘤免疫逃逸作用，进而参与ICIs的获得性耐药［26］。

4 治疗策略

综上，ICIs获得性耐药与肿瘤微环境中Tregs密切相关，靶向Tregs治疗是消除ICIs耐药性的有效手段。在未来的研究中，可以从Tregs表面免疫检查点蛋白、GITR、TGF-β信号等寻找靶点，特别是采用联合治疗的策略以增强肿瘤患者对ICIs治疗的响应。免疫共刺激分子和共抑制分子，特别是肿瘤坏死因子受体超家族的一些免疫检查点分子，如OX40、诱导T细胞共刺激分子（inducible T cell co-stimulator，ICOS）和糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因（glucocorticoid-induced TNFR family related gene，GITR）也被用作Treg靶向治疗。GITR单克隆抗体DTA-1亦被证实能够下调肿瘤浸润组织中Treg FOXP3的表达，GITR抗体联合ICIs治疗还能够进一步增加Teff细胞的肿瘤杀伤效应［27-28］。在Treg中，靶向TGF-β可能是抗肿瘤治疗的另一种方法。如RAVI等［29］研究发现，CTLA-4或PD-L1抗体治疗联合抑制TGF-β信号，能够显著降低肿瘤组织浸润的Treg细胞数量，促进黑色素瘤小鼠模型的抗肿瘤细胞毒性作用。

5 结论与展望

对ICIs的反应完全取决于肿瘤微环境中分子和细胞网络的类型。肿瘤组织若存在较高的肿瘤突变负荷、大量高免疫抑制性免疫细胞，如表达高水平CTLA-4和PD-1的Treg，则采用单一或联合免疫检查点抑制剂治疗较为有效。随着时间的推移，肿瘤细胞在治疗压力选择下，通过产生更多的自身抗原来增强Treg功能，并通过寻找代偿途径来逃避抗肿瘤免疫反应，从而降低肿瘤的免疫原性并产生了获得性耐药。为了克服这种耐药性并提高抗肿瘤免疫反应，新的ICIs、联合其他ICIs或小分子抑制剂（如代谢抑制剂、表观遗传修饰剂和免疫刺激剂）的研究也是非常有益的尝试。另一方面，在治疗期间及治疗之后，测定外周血和肿瘤组织中Treg的水平/表型对于判断与Treg介导的ICIs获得性耐药的生物标志物亦至关重要。这些研究将有助于确定最适合癌症患者的治疗方法，并最大限度地提高治疗效果。