金属纳米团簇的合成及抗菌效应的研究进展

王玉先，张红漫，朱丽英，江 凌，黄 和

（1.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京211800；2.南京工业大学 化学与分子工程学院，江苏 南京211800；3.南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京211800；4.南京工业大学 药学院，江苏 南京211800）

目前，抗生素滥用所引起的细菌耐药问题已持续对公共卫生产生重大威胁，因此迫切需要开发新型抗菌剂来替代传统抗生素。纳米抗菌材料（nanoantimicrobial materials）是一类或自身具有抑菌作用，或能作为载体提高抗菌剂给药的有效性和安全性的材料，如石墨烯、碳纳米管等非金属纳米材料以及金、银、铜等为主的金属纳米材料。这些纳米材料具有尺寸分散、比表面积大和高反应活性等特点，一方面可以通过物理化学作用破坏细胞膜的完整性，另一方面可以产生大量的活性氧（ROS），从而抑制细菌、真菌等微生物的生长和繁殖［1］，因此越来越多的研究者致力于开发新型纳米抗菌材料来治疗细菌引起的感染性疾病。

目前，金属纳米材料因其特殊的物理化学性质广泛应用于催化［2］、传感［3］和生物医学［4］等领域。金属纳米材料根据其尺寸大小可分为两个尺度范围：纳米颗粒（NPs）和纳米团簇（NCs）［5］。NPs具有独特的光学性质、电学性质、催化性质以及良好的稳定性，粒径为10～100 nm；NCs是由少则数个、多则上百个原子组成的粒径小于3 nm的团簇。NCs这类超小纳米粒子表现出独特的电子（与费米波长相当）和光学性质（荧光发射可调、光致发光和光稳定性等），具有强大的量子尺寸效应［6］。Xue等［7］研究发现，金属纳米材料能够穿透细胞壁进入细胞内，与蛋白质上的巯基反应，引发细胞内的酶失活、代谢紊乱。而Niu等［8］发现，金属纳米材料能破坏微生物的电子、物质传输系统和呼吸系统，从而产生抗菌效应。由于传统的金属纳米颗粒对人体正常细胞存在毒副作用，这限制了其在临床中的应用，而M NCs由于具有超小的类分子结构，容易被肾脏清除出体外，大大降低了材料自身的毒副作用。新加坡国立大学的谢建平教授团队在不同分子量M NCs的设计、合成及性能方面进行了详细的研究［9－10］，这些M NCs对不同种类细菌均表现出广谱性的抗菌性能，进一步扩大了这类超小M NCs在生物医学和环境工程中的应用。此后，更多的研究者开始关注这类新型纳米抗菌材料。

1 金属纳米团簇的合成及性质研究进展

金属纳米团簇（M NCs）是一种以金属为核，表面被不同有机配体修饰的纳米材料，是介于原子和纳米颗粒之间的过渡态［5］，具有精确的原子组成及结构，配体保护的M NCs可以用［Mn（SR）m］q表示（m、n和q分别为M NCs中的金属原子M、配体SR以及净电荷的数目）。M NCs根据合成路径的不同可分为“自下而上”和“自上而下”两种方法［11］，前者通常是金属离子（Mn＋）在还原剂（如NaBH4）存在下被还原成金属原子（M0），然后再在配体上逐渐成核生长，形成所需尺寸的M NCs。目前，“自下而上”工艺是制备M NCs最广泛使用的方法，具有产率高、合成时间短和反应过程简单等特点，但控制好还原动力学是形成高质量M NCs的关键。“自上而下”工艺则是通过配体对大尺寸纳米颗粒的蚀刻作用合成超小尺寸的纳米簇，该过程需要一个特定的反应环境来促进可控的蚀刻反应，因此，与“自下而上”相比，“自上而下”工艺更耗时且产率低。目前，常用于合成金属纳米团簇的有机配体以巯基为主，因为配体中的硫原子与金属原子之间可以形成强的共价键，可对M NCs起到良好的保护作用。许多具有精确原子数目的NCs已经被报道，如以Au、Ag、Cu、Pt和Pd等为核的精确原子纳米团簇以及由这些金属复合物形成的二元或多元纳米团簇［12］。针对不同金属原子的纳米团簇的特点，分别对其常用的合成方法及性质进行了介绍。

1.1 金纳米团簇（Au NCs）

Au NCs是M NCs中稳定性最好的材料之一。最初，人们利用Au原子与S原子之间强的共价作用力，选择含巯基的生物分子为稳定剂，在适当的条件下还原Au3＋来制备Au NCs［13］。通过这种方法，一方面人们可以选择合适的配体来调节Au NCs的光学性质；另一方面可以获得低毒性的纳米材料，使Au NCs具有良好的生物学应用价值［14］。Murray团队的Huang等［15］利用硫醇分子作为配体合成的Au NCs粒径约为1.8 nm，激发波长为780 nm。随后，Link等［16］以谷胱甘肽（GSH）为保护剂合成含有28个金原子的纳米簇。自此以后，越来越多的精确原子Au NCs也相继被成功制备出来，如

除了这些含巯基的小分子外，一些生物大分子也常被用作合成Au NCs的配体。如：Ying等［24］以牛血清白蛋白为稳定剂和还原剂，发展了一种绿色方法合成出了发红色荧光的Au NCs，其量子产率能达到6%；Thomas［25］还尝试利用DNA分子中的胞嘧啶与金属原子之间的强亲和力来制备DNA稳定的纳米团簇，获得了具有蓝色荧光的Au NCs；Liu等［26］也使用不同的DNA模板成功合成出了荧光Au NCs。

1.2 银纳米簇（Ag NCs）

Ag NCs与Au NCs的相似处在于都能够通过含巯基的配体在还原剂的作用下形成纳米簇，不同之处在于Ag NCs更容易使用不同的模板来合成。但是，Ag NCs易受外界条件的影响，导致稳定性差，尤其是大气中的O2和溶液中一些电子受体的氧化作用。因此，有关Ag NCs的研究主要集中在如何提高其稳定性以及量子产率［27］。Zheng等［28］以羟基封端的聚酰胺-胺型树枝高分子（PAMAM）为配体，利用羟基来俘获Ag＋从而形成水溶性稳定的Ag NCs，其发射波长为533～648 nm，具有良好的光稳定性。Yuan等［29］以超支化聚乙烯亚胺（hPEI）为配体，在抗坏血酸的还原下成功合成了蓝绿色荧光发射的Ag NCs，该NCs具有很好的pH稳定性。

蛋白质由于其自身含有多个结合位点，也常被应用到Ag NCs的合成中。Narayanan等［30］合成了糜蛋白酶稳定的Ag NCs，该纳米簇激发波长为500 nm，发射波长为680 nm，具有出色的光稳定性。Cui等［31］利用人工合成的多肽序列制备了一系列Ag NCs，该纳米簇在不同碱性条件下能够发出蓝色和红色的荧光。

DNA与Ag＋之间也存在相互作用，即Ag＋与胞嘧啶之间的强亲和力，使得DNA成为合成Ag NCs的很好模板。Richards等［32］使用不同DNA模板合成出不同发光颜色的Ag NCs，发现Ag NCs的光稳定性随着激发波长的增加而逐渐减弱。最近，Wang课题组的Guo等［33］发现杂交后的双链DNA也可以形成稳定的荧光Ag NCs。

1.3 铜纳米簇（Cu NCs）

与Au NCs和Ag NCs相比，Cu NCs的相关研究并不多。事实上，与贵金属相比，铜具有价格低廉和高导电率的优势。同时，Cu NCs也具有M CNs所共有的特性，因此，Cu NCs在生物成像、生物传感等方面也有着广阔的应用前景［34］。尽管如此，Cu NCs的合成方法还是较少，这主要是由于Cu NCs很容易被氧化且制备过程中的尺寸大小难以控制。同金、银纳米簇的制备一样，含巯基的配体仍然可以与Cu2＋形成Cu—S键。Wei等［35］以2-巯基-5-丙烷基嘧啶为配体，通过NaBH4的还原得到具有双发射波长的Cu NCs。一些生物大分子（如多肽、蛋白质和DNA等）也能作为配体为Cu2＋提供结合位点形成稳定的Cu NCs［36－37］。

1.4 其他金属纳米团簇

除了上述常见的3种金属纳米团簇之外，以铂、钯金属为中心的M NCs被相继合成出来。Kawasaki等［38］以及Hyotanishi等［39］分别用金属铂和金属钯，采用绿色一步法合成出了相应的M NCs，其合成方法与前面的类似，只是将HAuCl4换成了H2PtCl6和PdCl2。目 前，Inouye团 队 的Tanaka等［40］使 用NaBH4为还原剂，以PAMAM为稳定剂成功合成出水溶性的Pt NCs，该纳米簇在360 nm紫外灯照射下发出强的蓝色荧光。

2 主要金属纳米团簇的抗菌性能研究现状

2.1 单一金属纳米团簇的抗菌效应

由细菌引起的传染病是全世界最重要的卫生挑战之一，每年困扰着数百万人［41］。目前，M NCs被广泛开发用于抑制和减少有害细菌的生长，其中，Ag NCs由于Ag＋与微生物界面间独特的化学特性而在抗菌方面的应用最广泛。Setyawati等［42］以谷胱甘肽（GSH）修饰不同氧化状态的Ag NCs（Ag＋和Ag0），结果发现，具有丰富Ag＋的Ag NCs对革兰氏阴性菌（P.aeruginosa、E.coli）和革兰氏阳性菌（B.subtilis、S.aureus）都具有明显的抑菌作用。Jin等［43］以二氢硫辛酸（DHLA）为配体，修饰后的Ag NCs对革兰氏阴性菌（E.coli）的抑制作用明显高于革兰氏阳性菌（S.aureus）。Li等［44］从生物氧化代谢机制角度出发，以核黄素（RF）修饰Ag NCs，形成的RF@Ag NCs不仅可以产生高水平的ROS，还能够破坏细胞膜的完整性，从而杀死细菌。

金纳米颗粒（Au NPs）具有更好的生物相容性、更好的热稳定性和光稳定性，并且对人体细胞的细胞毒性相当低，Au NCs同样具备了Au NPs的这些特性。最初，人们认为Au原子由于其惰性而不具备抑菌作用，因此形成的金纳米材料亦如此。但是，Xie团队的Zheng等［45］在设计合成具有精确原子数的Au NCs上做了大量工作，其中以二巯基丙酸（MHA）为配体的Au24（MHA）18表现出抑菌作用，打破了人们对金纳米材料无抗菌性的传统认识。为了进一步考察Au NCs表面性质对细菌的作用，Zheng等［46］研究金纳米簇表面配体化学所产生的抑菌作用时发现含有丰富—COOH基团的配体（MAB和MBA）表现出比含有—NH2基团的配体（Cys）更强的抑菌作用。Zheng等［47］以不同结构的巯基吡啶为配体，合成了一系列带不同电荷的Au NCs，经研究发现，带正电荷的Au NCs对超级细菌（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA）表现出强的抑制作用。

2.2 金属纳米团簇联合抗菌物质增强抗菌效应

抗生素是目前临床上治疗细菌感染的主要药物，但往往需要较高的浓度才能发挥作用，这样就导致抗生素的杀菌效率低、生物毒性大，限制了其在临床上的进一步应用。将纳米材料与某些具有杀菌作用的药物联合使用，已成为一种提高抗菌效应的有效方法。Kalita等［48］研究了一种溶菌酶为配体的Au NCs（AUNC -L），并在其表面功能修饰β-内酰胺类抗生素氨苄西林（Amp），从而得到一种高效的抗菌杂化物（AUNC -L-Amp），结果发现，这种抗菌杂化材料不仅恢复了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）对Amp的敏感性，而且表现出对非耐药菌株高效的抗菌活性；在小鼠动物模型中，腹腔注射该杂化材料可消除系统性MRSA感染，局部应用可根除糖尿病大鼠难治性创面MRSA感染，加速愈合过程。Zheng等［49］将谷胱甘肽（GSH）稳定的Ag NCs与达托霉素（Dap）结合，形成的抗菌复合物（Dap-Ag NCs）表现出比简单物理混合的Dap＋Ag NCs更强的破坏细胞膜的能力，从而起到抑菌的效果。抗菌肽是具有广谱抗菌活性的一类天然多肽，与传统抗生素不同的是抗菌肽主要通过直接破坏细菌细胞膜的完整性来杀灭细菌。因此，将天然抗菌肽与纳米材料有效结合为开发新型高效的抗菌药物提供了新的可能。Wang等［50］以杆菌肽为模板合成了3种新型水溶性的M NCs来包裹Au、Ag或Cu原子，形成的抗菌M NCs不仅表现出不同的荧光特性，更重要的是M NCs与杆菌肽的高效协调作用显著增强了对S.aureus的抗菌效果，实现了成像与抗菌于一体的多功能抗菌复合材料的制备。

一些阳离子化合物由于其带正电可以通过静电作用黏附于带负电的细菌表面，然后通过改变细菌表面的电位以及破坏细胞膜蛋白从而导致细菌的死亡。Xie等［51］以谷胱甘肽为还原剂，通过一锅法合成了包括季铵盐（QA）、Nona -精氨酸肽（R9）和转录反激活肽（TAT）在内的带正电荷的功能化Au NCs，通过测定其在革兰氏阳性菌（S.aureus、MRSA）、革兰氏阴性菌（E.coli）和多重耐药E.coli中的最低抑菌浓度（MIC）后发现：QA -Au NCs对4种靶向细菌表现出较好的抗菌效果，这可以归因于QA -Au NCs表面的正电荷可以促进静电吸附到带负电荷的细菌细胞膜上；QA -Au NCs引起了S.aureus膜完整性的破坏，膜通透性的增加和膜电位的耗散；QA -Au NCs还可以促进活性氧（ROS）的产生，最终导致细菌死亡。Xu等［52］研究具有抗菌能力的聚乙烯亚胺（PEI）封端的银纳米簇（PEIAg NCs）的抗菌活性，结果发现，PEI-Ag NCs具有较高的抗菌能力，而且降低PEI的分子量可以显著提高PEI-Ag NCs的抗菌性能。

2.3 金属纳米团簇与其他纳米材料复合增强抗菌效应

单一的M NCs虽然在一定程度上已经具备良好的抗菌效果，但也存在一定的局限性，如一些金属材料价格昂贵，对正常细胞的毒理学与安全性问题还有待进一步研究。因此，研究开发具有协同杀菌作用的纳米复合物成为研究的热点。壳聚糖（CS）是一种具有良好生物相容性和自然可降解的生物大分子，其自身具有抗菌作用并对哺乳动物表现出低的细胞毒性作用，因此广泛应用于细菌感染性的伤口愈合。Girija等［53］研究了一种基于超小Au NCs和CS自组装的抗菌纳米聚集体，与单一组分的纳米材料相比，该聚集体对E.coli和S.aureus均表现出更强的抗菌活性，但对哺乳动物细胞的存活率却无影响，而且这些纳米聚集体能够促进伤口的愈合，这为开发和设计用于治疗伤口感染的抗菌纳米聚集体提供了新思路。Mishra等［54］制备了PEG修饰的壳聚糖水凝胶膜，并将Ag＋吸附在多孔膜结构中，这些Ag＋在配体保护下被还原成约3 nm的Ag NCs，从而得到Ag NCs@PEG- CS复合材料，经研究发现：Ag NCs的存在不仅可以提高膜的力学稳定性，而且还降低了它们在溶菌酶和H2O2存在下的降解敏感性；体外抗菌实验结果表明，该复合材料可以抵御细菌生物被摸的形成，从而起到抵抗细菌感染的作用。

M NCs除了与有机分子形成复合材料之外，还能与一些无机材料形成纳米复合物。Liu等［55］采用一锅法合成了高分散的Ag NCs修饰的介孔SiO2纳米颗粒（Ag NC -MSNs），这种新型的纳米复合材料具有广谱性的抗菌作用，抗菌能力比Ag NP和Ag NP修饰的SiO2（Ag NP -MSNs）分别提高了17倍和27倍，而且这种复合材料能够长期有效地释放Ag＋，达到缓控释放药物的目的。Zheng等［56］设计了一种顺磁性金属离子钬（Ho3＋）配位化合氧化石墨烯纳米片（GO）的复合材料（Ho -GO），并将Au NCs结合在Ho-GO表面形成三元复合材料（Ho-GO-Au），结果发现：这种新型的复合材料一方面能够排列形成具有高密度的锋利边缘，可高效地切割细菌的细胞膜，提升物理杀菌作用，再加上Ho-GO表面丰富的官能团有利于它更好地与菌体接触，从而产生更高水平的ROS以实现化学杀菌；另一方面，超小尺寸的Au NCs能够进入细菌内部，造成细菌代谢功能紊乱，诱使其产生大量ROS，同样达到杀菌的目的。因此，这种新型三元复合材料可以结合GO和Au NCs具有的物理杀菌机制和化学杀菌机制，实现广谱和高效地协同杀菌作用。

3 金属纳米团簇的抗菌机制

与传统的金属纳米材料抗菌机制一样，M NCs一方面通过释放金属离子与细菌发生作用，另一方面通过材料自身的物理化学性质破坏细菌的内部结构，从而产生抗菌效应。带正电荷的金属纳米材料首先通过静电作用附着在细菌膜表面，然后逐渐渗透到细菌体内，通过改变膜的通透性来破坏细菌膜，进而杀死细菌［57］。当金属纳米材料的粒径减小到NCs范围，M NCs可以显著提高其与细菌膜之间的相互作用，因此表现出更高的抗菌效应［45，58］。在M NCs进入细菌胞内后，高效的类酶催化性质可以通过影响菌体的氧化应激能力进一步发挥抗菌作用，如Au NCs可以上调氧化应激相关代谢酶基因（narJ、narK）的表达，下调抗氧化应激相关代谢酶基因（ilvC）的表达，从而产生高水平的ROS［45］。除此之外，细胞代谢和内化在调节M NCs的抗菌活性方面也起着作用。因此，M NCs可通过膜损伤、氧化应激以及代谢失活协同作用诱导细菌细胞死亡。

4 结论与展望

M NCs比传统的纳米颗粒具有更加与众不同的光学、电学和化学性质以及优异的光稳定性、良好的生物相容性，使得它们能够作为新兴的功能材料用于生物医学领域。特别是，这类材料所表现出的高效杀菌作用可解决目前抗生素滥用所导致的细菌耐药性问题，因此受到研究者的青睐。尽管如此，M NCs还面临着诸多问题。从材料本身来说，纳米簇-保护基团复合物的配位性质决定了M NCs的稳定性受到强竞争配体存在的影响，这就导致M NCs在复杂生物体内的稳定性受到挑战。从功能角度来说，开发生物分子功能化的M NCs还处于起步阶段，开发同时兼具诊断和治疗功能的抗菌材料还需要进一步研究，以达到应用的目的。从抗菌效应上来说，如何与其他材料复合来进一步提升抗菌效果以及多角度探讨抗菌机制也是具有突破性的发展方向。总之，M NCs的不断发展将为临床细菌感染的治疗提供广阔的应用前景。