α-芋螺毒素LvIA第11位氨基酸的新突变体合成及其靶点活性

李浩楠，杨奕帅，长孙东亭，朱晓鹏，罗素兰

（1.上海儿童医学中心 三亚市妇女儿童医院 药学部，海南 三亚 572000;2.海南大学 热带生物资源教育部重点实验室/海口市海洋药物重点实验室/生命科学与药学院，海口 570228）

芋螺（Cone snail）是一种肉食性海洋软体动物[1]，其分泌的芋螺毒液包含许多不同化合物的混合物，包括小分子、肽和酶。其中，含有很多种不同成分的神经活性毒素肽-芋螺毒素（Conotoxin,CTx）具有广泛的多样性，这些具有高活性和靶点选择性的神经小肽大多由6～50个氨基酸残基构成，富含二硫键，以特定的离子通道和受体为靶标，作为药理学工具和探针，具有较好的开发前景[2-4]。α-芋螺毒素 (α-conotoxin,α-CTx) 是目前研究最广泛和深入的CTxs。α-CTx分子质量较小，由12～20个氨基酸残基连接构成，是各种乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）亚型的选择性拮抗剂[5-6]。α-CTx一般含有4个半胱氨酸（Cys），根据二硫键的不同连接方式，可组成3种异构体，其中，大部分α-CTxs的活性形式为球型。另外，根据α-CTx半胱氨酸间氨基酸数量的不同将α-CTx分为：α-3/5、α-4/4、α-4/6、α-4/7等多种亚家族。α-CTx不仅作为分子探针，用以鉴别不同亚型的nAChR，在治疗与nAChR相关疾病时有着至关重要的作用[7-9]，并且在成瘾、镇痛等神经生理、药理研究方面也扮演重要角色[10]。

罗素兰研究团队从疣缟芋螺中分离得到了一种α-4/7型CTx LvIA，它由15个氨基酸残基组成，能够作用于nAChRs，对α3β2 nAChR具有较好的的活性（IC50为8.7 nmol·L-1），但是LvIA对α6/α3β2β3，α3β4和α6/α3β4 3种nAChRs亚型保持一定的高亲和力[11-13]。为了提高LvIA的选择专一性，前期实验室基于LvIA进行了设计和改造，获得了对应的共晶结构，同时也利用受体突变技术解析了它与α3β2 nAChR相互作用的分子机制[14-15]。研究发现，当第11位天冬氨酸（Asp,D）突变成丙氨酸（Ala,A）后对α3β2 nAChR的活性保持不变，共晶实验表明，第11位氨基酸影响着LvIA与α3β2 nAChR的结合作用[16-19]。第11位是否是LvIA的关键氨基酸位点，今后能否基于该位点对LvIA进行改造，有待深入研究。

本研究基于LvIA前期研究发现的关键氨基酸信息[20-22]，主要是针对第11位氨基酸，对LvIA进行进一步设计改造，分别用精氨酸（Arg,R）和组氨酸（His,H）对Asp进行取代，设计了2种新型突变体，考察第11位氨基酸电性和侧链基团对LvIA活性的影响，旨在为LvIA的设计和开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器α-CTx LvIA及其所有突变体线性肽粗品（吉尔生化上海有限公司），色谱级三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），色谱级乙腈(Acetonitrile,ACN)（ThermoFisher Scientific公司），N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、碘(I2)、铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])、甲酸等分析纯试剂（广州化学试剂厂），质粒提取试剂盒(Omega)，胶原酶(Collagenase)、乙酰胆碱(ACh)、阿托品(Atropine)（Sigma公司），DNA纯化试剂盒（TaKaRa大连有限公司），体外转录试剂盒（Fisher Scientific公司），胶原蛋白酶A（美国Sigma-Aldrich公司），圆二色谱检测涉及的试剂由华中科技大学分析测试中心提供；Waters 2695制备型高效液相色谱仪，Waters e2695分析型高效液相色谱仪（美国Waters公司），岛津电喷雾电离质谱(Electrospray ionization-mass spectrometer，ESIMS)（美国格雷斯公司），双电极电压钳系统Axon 900A和Digidata 1550B数模转换器（美国Molecular Device公司），ELGA超纯水系统（英国ELGA公司）；分光光度计(Smart SpecTM plus)（美国Bio-RAD公司），AlphaImager HP凝胶成像系统（美国Protein Simple公司）；实验用非洲爪蟾（美国Nasco公司）。

1.2 [D11R]LvIA和[D11H]LvIA的合成和氧化折叠设计2种LvIA第11位突变体序列送至上海吉尔生化有限公司，使用固相合成法（Fmoc法）进行合成（纯度为80%～85%）。然后使用制备型RP-HPLC对合成好的线性肽进行纯化，使产物的纯度达到95%以上。纯化得到的线形肽采用两步法氧化的方法进行氧化折叠，保证形成I-III,IIIV的二硫键连接结构。第1步氧化，将纯化后的线性肽冻干粉溶于B60(60%乙腈)，缓慢地滴加到铁氰化钾反应液(K3[Fe(CN)6]10 mmol·L-1,Tris 0.1 mol·L-1,pH7.5)中，室温充分反应45 min，促使其形成第1对二硫键(Cys-2和Cys-8)，线性肽浓度不高于50 g·L-1。利用RP-HPLC纯化反应后得到单环产物。将第1步纯化后的多肽进行第2步氧化。在氮气保护的条件下，逐滴加入到碘(I2)反应液中（7.5 mmol·L-1I2溶液；V水∶VTFA∶VACN=73∶3∶24），反应时间8～12 min,促使其 连接Cys-3和Cys-16形成第2对二硫键，反应完毕滴加VC饱和溶液至溶液颜色从紫黑色变成无色，终止I2氧化反应，至此，得到包含2对二硫键的LvIA突变体的最终产物。使用RP-HPLC对氧化折叠产物进行纯化（溶剂A为0.075%TFA水溶液，溶剂 B为0.05% TFA、90% ACN,梯度洗脱条件：5%～35%），使其纯度大于95%，纯化得到的氧化折叠产物利用ESI-MS鉴定其分子质量，确定LvIA及其突变体是否形成正确的二硫键连接方式。冻干保存，用于后续电生理活性实验。

1.3 乙酰胆碱受体模型的建立从载入了含（rat，r）α3、β2 2种亚基基因质粒的DH5α感受态细胞中提质粒，将获取的质粒酶切成线性质粒，然后纯化此线性化DNA模板，利用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检验纯度，并使用Nanodrop测定浓度。使用T7 RNA polymerase体外转录试剂盒将DNA模板转录，转录后的RNA使用纯化试剂盒进行纯化，纯化的产物cRNA，再使用分光光度计测定浓度，并使用0.8%的琼脂糖凝胶进行纯度鉴定。选取1只腹部没有斑点的非洲爪蟾，冰冻1 h麻醉，使用手术刀将爪蟾的腹部下侧切开，用剪刀将肌肉剪开，取2片蛙卵置于OR-2溶液中，再用胰蛋白酶酶解成单个蛙卵，至大部分卵母细胞表面无膜，挑选其中个体均匀，无血丝，黑白分明的爪蟾卵母细胞。按照1∶1的比例混合成所需的亚型，保证每个细胞的注射量为50.6 nL，注射后的蛙卵置于含抗生素的ND96培养液中（96 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1KCl，1.8 mmol·L-1CaCl2，1 mmol·L-1MgCl2，5 mmol·L-1HEPES，pH7.1～7.7；抗生素：青霉素、10 mg·L-1链霉素和100 mg·L-1庆大霉素），17 ℃培养2～3 d，表达α3β2受体亚型。

1.4 LvIA突变体活性的检测将表达了特定受体的卵母细胞放置于细胞槽内，将双电极电压钳装好holder，再把灌注约1/23 mol·L-1KCl溶液的电极针安装到holder上，将电极针浸入液面，调零，使其钳制电压为70 V,基准电流低于100 nA，将电压膜片钳打开到ON的模式，钳住细胞，调节程序，每个Sweep（1 min）的第2秒的时候灌流系统给予蛙卵细胞100 μmol·L-1浓度的ACh刺激，其余时刻持续使用ND96溶液灌流。使用双电极电压钳系统检测和记录蛙卵细胞的电流，待电流大小稳定以后，逐次加入经过梯度稀释的待测定活性的LvIA突变体，孵育时间为5 min，再一次开启程序，比较蛙卵细胞加药前后2次产生电流的的大小差异，计算反应率（Response）。通过非线性拟合方程：Response=100/[1+([toxin]/IC50)nH]×100%进行拟合分析，获取药物作用的剂量反应曲线（IC50值），其中，nH代表Hill系数。

2 结果与分析

2.1 LvIA突变体合成纯化线性肽，使其纯度高于95%，用于后续的氧化折叠反应，连接2对二硫键，将所得产物通过HPLC和MS鉴定，具体结果见图1-A、B。[D11H]LvIA在乙腈浓度23%时洗脱，洗脱时间为14.8 min；而[D11R]LvIA在乙腈浓度为25%时洗脱，洗脱时间是14.9 min。通过质谱确定了[D11H]LvIA和[D11R]LvIA的相对分子质量，分别为1702.95和1721.99Du，与理论值一致，且均比其线性肽的相对分子量少了4 Du，说明成功连接了2对二硫键并且末端酰胺化，见图1-C、图1-D。

图1 LvIA突变体的HPLC和MS结果

2.2 乙酰胆碱受体模型建立提取包含鼠源α3、β2这2种亚基的质粒，使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测。从图2-A可知，质粒条带清晰，未发生拖尾情况，超螺旋结构大小在2500 bp左右，符合理论值大小。从图2-B可知，条带清晰可见，无弥散现象，超螺旋结构的大小在5000～7500 bp范围内。使用紫外分光光度计测定线性质粒的质量浓度，质量浓度皆大于0.2 g·L-1，可以保证后续试验的浓度要求。制备α3、β2这2种亚基的cRNA，所得RNA的凝胶电泳结果如图2-C，图中有1条明显的亮带，大小在750～1 000 bp之间，符合理论值，α3亚基的浓度为0.4 g·L-1，β2亚基的浓度为0.49 g·L-1。将2种亚基按照1∶1的比例混合，显微注射到酶解好的爪蟾卵母细胞中(图2-D)，表达2～3 d，使用激动剂ACh刺激，可以在细胞膜上检测到内向电流,电流大小在200～2000 nA范围内，如图2-E。

图2 α3β2 nAChR模型的建立

2.3 LvIA突变体活性检测分别将LvIA和2种11位的LvIA突变体在表达α3β2 nAChR的非洲爪蟾卵母细胞上进行电生理活性检测。在终浓度为10 μmol·L-1的孵育条件下，LvIA、 [D11R]LvIA和[D11H]LvIA对α3β2nAChR的 阻 断率分别为(95.8±2.8)%（n=6）、(9.8±2.5)%（n=7）和(12.4±3.1)%（n=5）（图3），与野生型LvIA相比，2种11位突变体对α3β2 nAChR活性几乎完全丧失。

图3 LvIA及突变体对于α3β2 nAChR的电流轨迹图

为了进一步确定2种LvIA 的11位突变体对于α3β2 nAChR的阻断活性，笔者做了剂量反应曲线(图4)，分别测定了[D11R]LvIA和[D11H]LvIA对α3β2 nAChR的IC50值，2种突变体对于α3β2 nAChR的IC50值分别为8976 nmol·L-1和6390 nmol·L-1（表1），活性与比本体的活性相比，分别降低了574.38%和408.62%。证明当第11位的Asp变化后，LvIA的活性大大降低。

图4 LvIA及其突变体对于α3β2 nAChR的浓度反应曲线

表1 LvIA 及11位突变体在α3β2 nAChR上的IC50

3 讨 论

α3β2 nAChR 是一种十分重要的受体，与疼痛、成瘾等生理学作用密切相关。LvIA是一种十分重要的α-CTx，作用于α3β2 nAChR，是从疣缟芋螺中发现并且克隆得到的，对LvIA构效关系的研究将有益于获得靶向α3β2 nAChR的相关分子探针，有助于对与α3β2 nAChR相关的药理学研究。目前，发现能够作用于α3β2 nAChR的α-CTx的有很多，其中，GIC、MII、OmIA和PeIA等具有较强的靶向作用，针对这些芋螺毒素的突变改造对于本实验具有借鉴作用[23-24]。如：在对α-CTx MII的研究中发现，MII第11位的谷氨酸（Glu）与α3-β2亚基上带正电荷的残基如：(+) K153和(-)K163形成相互作用，促进MII与α3β2 nAChR的结合，11位对保证MII的活性至关重要[25]。利用共结晶技术对α-CTx GIC的研究发现其第7位的Ala、11位的Asn和12位的Asn对于GIC与受体的结合具有十分重要的作用，特别是11位的Asn可以通过形成氢键与Ac-AChBP相互作用，如果改变11位的氨基酸，会影响GIC与受体的结合，11位氨基酸对于α-4/7型CTxs与受体的结合起到至关重要的作用[26]；在PeIA的相关研究中，也发现11位氨基酸分别突变为Arg和Lys之后，对α3β2 nAChRs的IC50分别变为30.9μmol·L-1和45.4 μmol·L-1，基本丧失了活性[27]，上述结果都证明了11位氨基酸对于α-4/7型CTx活性影响显著。

根据前期研究，发现β2亚基上的3个位点：T59K、V111I、F119Q对α-CTx LvIA的敏感性有显著影响，受体突变加电生理结果表明受体上59、111和119的3个位置，是与LvIA结合的关键位点。罗素兰研究团队对LvIA前期研究中，获得了LvIA与Ac-AChBP的共晶结构。借助共晶结构和分子动力学模拟发现α3亚基中的Lys-155可以与LvIA中带负电荷的Asp-11形成盐桥，增加相互作用，说明第11位的Asp对于LvIA与α3β2 nAChRs的相互作用影响较大，但是将第11位突变成Ala之后活性保持不变，所以本研究希望在前期基础上进一步深入探究第11位如何影响LvIA对于α3β2 nAChRs的活性，针对11位所设计的两个突变体[D11R]LvIA和[D11H]LvIA，当第11位氨基酸突变成碱性氨基酸Arg和His之后，2个突变体的活性都极大的降低。结合前期共晶结构和分子动力学模拟分析，当11位突变为碱性氨基酸后，与α3亚基中的Lys-155都为碱性氨基酸，同性相斥，结合力减弱，造成了LvIA活性的降低。该研究探究了11位的重要作用，为今后基于LvIA的分子设计和改造提供了基础。