miR-140-3p靶向调控KMT5B对老年牙髓干细胞成牙本质分化的影响及机制

刘帆 宋楠 安琪

(1东南大学附属中大医院江北院区口腔科，江苏 南京 210000；2长春市口腔医院牙体牙髓科)

人牙髓干细胞(hDPSCs)是具有高度增殖能力及多向分化潜能的成体间充质干细胞，牙髓损伤发生后牙髓干细胞可迁移至损伤部位并发生定向分化，进而促进修复，因此牙髓干细胞成牙本质分化在牙齿再生过程中发挥重要作用〔1～3〕。既往研究显示，不同年龄组和代数的干细胞生物学活性具有一定程度差异〔4，5〕，微小RNA(miR)-140-3p可参与多种干细胞凋亡、分化、增殖等，且与人骨髓间充质干细胞衰老有密切关系〔6〕。甲基转移酶(KMT)5B与细胞增殖、分化等联系密切，且涉及机体多种器官、细胞、组织，在牙齿再生、发育过程中发挥至关重要的作用〔7〕。本文拟分析miR-140-3p靶向调控KMT5B对老年牙髓干细胞成牙本质分化的影响及机制。

1 材料与方法

1.1研究材料 主要试剂：RPMI1640培养基(武汉益普生物科技有限公司)，DMEM培养基(美国Sigma公司)，牙本质涎磷蛋白(DSPP)、骨桥蛋白(OPN)、P21、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、关键转录因子Runt相关转录因子(RUNX)2抗体(abcam 公司)，二抗(北京索莱宝有限公司)，酶标仪、实时荧光定量PCR(赛默飞世尔公司)。研究细胞：收集本院因阻生齿或牙周病的老年患者健康完整恒牙，取出牙髓，分离、纯化获得牙髓干细胞，本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2细胞培养 牙髓干细胞放入含10%胎牛血清的DMEM培养箱，于37℃ 5%CO2、95%N2培养箱中培养，培养密度达到80%左右重复传代操作。

1.3hDPSCs中miR-140-3p、KMT5B mRNA相对表达量检测 提取未分化、分化hDPSCs中总RNA，逆转录为cDNA，采用实时荧光定量法鉴定miR-140-3p、KMT5B表达量，采用Primer5.0软件设计引物序列，miR-140-3p正义：5′-GGAGGGGATTCAAAGACCTA-3′，反义：5′-TTATTCCAAAGCTGCATGT-3′；KM-T5B正义：5′-GCATACAGCACTTACTCCCG-3′，反义：5′-TCGCGATGCTGATCACAAC-3′。启动PCR仪，反应体系：0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYBGreen，加蒸馏水至20 μl。反应条件：95℃ 3 min、95℃ 15 s、60℃ 40 s，72℃ 10 min，共进行40个循环，采用2-△△Ct方法计算出miR-140-3p、KMT5B的表达量。

1.4细胞转染 取对数牙髓干细胞，将其接种于6孔板，细胞融合至80%时，将培养细胞分为si-NC组(不做处理的牙髓干细胞)，si-miR-140-3p组(转染 miR-140-3p inhibitor)，KMT5B-NC组(转染KMT5B mimics的阴性对照)，KMT5B组(转染KMT5B mimics)，si-miR-140-3p+anti-KMT5B-NC组(转染miR-140-3p mimics阴性对照)，si-miR-140-3p+anti-KMT5B组(转染miR-140-3p mimics)，对其进行48 h培养。

1.5矿化结节相对数量检测 取对数生长期的hDPSCs细胞，将培养液弃去，通过40 g/L多聚甲醛固定，染色采用茜素红染液，通过倒置显微镜对矿化结节情况进行观察，Image-J软件定量分析，显微镜下计数5个孔，计算平均值，获得矿化结节相对数量。

1.6细胞增殖情况 采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况，调整测定细胞浓度，将其接种于96孔板中，并在孔板中加入200 μl细胞悬液，放入37℃、5% CO2环境中进行培养，2 h后加入10 μl MTT试剂，孵育4 h后采用酶标仪对OD值进行测定，并计算增殖率。

1.7Runx2、DSPP、OPN、P21、CyclinD1 通过Western印迹对Runx2、DSPP、OPN、P21、CyclinD1相对表达量进行检测，取细胞上清液，将50 μg蛋白加入凝胶缓冲液，加热变性。待凝胶电泳后转膜，取模，在4℃环境下进行1 h封闭处理，加入后分别加入1∶1 000 TBST给予稀释的Runx2、DSPP、OPN、P21、CyclinD1一抗，4℃孵育过夜保存，使用0.05%～0.10%Tris-HCl缓冲盐溶液+Tween去污剂进行洗膜，使用1∶10 000的二抗在室温下孵育1 h后TBST洗膜，二氨基联苯胺显色，使用Labwork凝胶图像扫描所获得胶片，以GAPDH为内参，计算Runx2、DSPP、OPN、P21、CyclinD1蛋白表达量。

1.8双荧光素酶报告试验 采用starBase网站对miR-140-3p靶基因进行预测，结果显示miR-140-3p中含有与KMT5B互补核苷酸序列，包括WT-miR-140-3p、MUT-miR-140-3p，将WT-miR-140-3p、MUT-miR-140-3p、KMT5B-NC、KMT5B转入hDPSCs细胞，进行双荧光素酶检测。

1.9统计学处理 采用SPSS26.0软件进行t检验、F检验。

2 结 果

2.1miR-140-3p、KMT5B在未分化牙髓干细胞、分化牙髓干细胞中的表达 与未分化牙髓干细胞(1.02±0.11、1.56±0.17)对比，分化牙髓干细胞miR-140-3p表达量(2.28±0.31)升高，KMT5B表达量(0.75±0.05)降低，差异有统计学意义(t=6.635、7.294，P=0.003、0.002)。

2.2干扰miR-140-3p对牙髓干细胞分化、增殖的影响 与si-NC组相比，si-miR-140-3p组miR-140-3p表达降低(P<0.05)，说明干扰miR-140-3p的牙髓干细胞构建成功。与si-NC组相比，si-miR-140-3p组矿化结节相对数量、Runx2蛋白、DSPP蛋白、OPN蛋白、OD值、CyclinD1降低，P21升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 干扰miR-140-3p对牙髓干细胞分化、增殖的影响

2.3KMT5B过表达对牙髓干细胞分化、增殖的影响 与KMT5B-NC组相比，KMT5B组KMT5B表达量显著升高(P<0.05)，表明上调KMT5B的牙髓干细胞构建成功。与KMT5B-NC组相比，KMT5B组矿化结节相对数量、Runx2蛋白、DSPP蛋白、OPN蛋白、OD值、CyclinD1降低，P21升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 KMT5B过表达对牙髓干细胞分化、增殖的影响

2.4miR-140-3p靶向调控KMT5B表达 双荧光素酶报告试验显示，与KMT5B-NC组(1.01±0.11、0.97±0.09)相比，KMT5B可使WT-miR-140-3p荧光素酶活性(0.31±0.04)显著降低(t=18.910，P=0.001)，对MUT-miR-140-3p荧光素酶活性(0.96±0.08)影响较小(t=0.263，P=0.796)。

3 讨 论

hDPSCs可接触介质硬度而向软骨及组织、平滑肌组织、神经组织等不同组织分化，正常情况下牙髓干细胞在牙髓组织中存在，当牙组织发生损伤时，牙髓干细胞可在微环境特定信号驱动下向损伤部位迁移并分化，最终起到修复损伤牙组织的作用〔8～10〕。

miRNA可通过特异性对靶基因进行识别并结合，进而参与细胞增殖、凋亡、细胞及干细胞功能重编程等生物过程，不同类型miRNA差异性表达可能与牙髓干细胞增殖、表型、分化的调控存在联系〔11〕。miR-140-3p可通过调控转化生长因子受体参与骨髓间充质干细胞的成脂、成骨分化〔12,13〕。研究表明〔14,15〕，miR-140-3p过表达时碱性磷酸酶(ALP)水平升高，而ALP是可参与骨矿化组织代谢、再生的主要物质，可促进钙化进程，同时可反映牙髓干细胞成牙本质分化情况，因此miR-140-3p对成牙本质分化具有促进作用。本研究结果表明，miR-140-3p可能为牙髓干细胞成牙本质分化的重要靶点。

相关学者研究发现〔16〕，KMT5B是可调控牙组织衍生的蛋白质，在牙髓干细胞缺氧情况下KMT5B表达呈上升趋势，可通过抑制DSPP、OPN表达降低ALP活性抑制牙髓干细胞的成牙本质分化，而在敲除KMT5B牙髓干细胞的缺氧受损分化能力增强，表明KMT5B对受损牙源分化具有抑制作用。本研究结果提示，miR-140-3p可靶向KMT5B调控牙髓干细胞矿成牙本质分化能力。

Runx2可与靶基因的启动子进行结合，进而对OPN、骨钙素等成骨相关靶基因起调控作用，对牙髓干细胞分化造成了影响，增强Runx2表达可促进牙髓干细胞矿成牙本质分化〔17〕。DSPP为典型成骨分化相关指标，对ALP活性、细胞增殖活性、钙结节产生具有促进作用，进而推动了牙髓干细胞骨形成〔18〕。OPN可与羟基磷灰石晶体进行结合，进而参与了钙离子信号传导过程，推动了初期矿化过程〔19,20〕。P21可使细胞周期延长，进而对牙髓干细胞增殖起抑制作用〔21，22〕。CyclinD1对细胞周期可起到调节作用，对G2/M期转变及有丝分裂具有促进作用，有利于牙髓干细胞增殖〔23,24〕。本研究结果表明，下调miR-140-3p可靶向调控KMT5B，影响牙髓干细胞矿成牙本质分化及增殖。

综上，miR-140-3p在牙髓干细胞矿化后表达升高，抑制其表达后牙髓干细胞矿化结节相对数量减少，分化相关指标水平下降，增殖受抑可能是通过调控KMT5B实现，表明干扰miR-140-3p可靶向调控KMT5B影响老年人牙髓干细胞成牙本质分化。