硒代胱氨酸逆转非小细胞肺癌TKI靶向药物耐药体外抗肿瘤的作用机制

刘露 董健 张勇 尹新洁

(1华中科技大学协和江北医院，湖北 武汉 430100；2湖北省荆门市第一人民医院)

相关流行病数据统计指出，2016年在世界范围内有140万人由于肺癌而失去生命，并且有超过180万例肺癌的发病人群，肺癌使人类的生存健康及日常生活均受到严峻的挑战〔1〕。此外，就我国国内临床的情况来看，牵涉到社会人口结构老龄化并且吸烟的情况没有显著好转，导致肺癌疾病在局部地区的发展趋势较不乐观，因此医学界正在积极应对肺癌带来的不良影响，不断优化临床肺癌相关的治疗方案。近年来提出的靶向治疗方法应用非常广泛，其也能够作为治疗非小细胞肺癌(NSCLC)在特定病理阶段的主要方式之一，临床的反馈表示其具有靶向精准及安全性明确等独特优势，靶向药物中的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在肺癌的临床治疗中使用较多〔2～5〕。TKI治疗机制涉及其通过突变的表皮生长因子(EGFR)导致酪氨酸活化过程出现异常从而精确对于EGFR的磷酸化过程进行阻断，并且通过影响和细胞凋亡存在联系的信号通路表达，加速肺癌细胞的凋亡过程，由于该类药物具有较为确切的疗效，现已作为EGFR阳性肺癌患者首选治疗药物〔6〕。但通过临床用药的长期观察，在患者治疗进行至8个月左右之后会出现与耐药相关的一系列情况，这是影响疗效的一大因素〔7〕。相关的研究发现，动物体及人体中必要的微量元素“硒”在一些肿瘤疾病的预防和治疗中意义重大，并且其对于逆转肿瘤耐药现象存在一定效果〔8～10〕，就其对于NSCLC耐药及体外抗肿瘤的作用鲜见研究。本研究探讨硒代胱氨酸逆转NSCLC TKI靶向药物耐药体外抗肿瘤的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与仪器 人NSCLC NCI-H1975 细胞株(购自上海歌凡生物细胞库)；硒代胱氨酸(SeC，购自河南康之旺生物科技有限公司)；吉非替尼(GEFITINIB)片(批准文号：H20090759，购自齐鲁药业)；胰酶(购自辽宁天医生物制药有限公司)；胎牛血清(FBS，购自上海康朗生物科技有限公司)；噻唑蓝(MTT，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒(均购自天津锐尔康生物科技有限公司)；单体三磷酸鸟苷结合蛋白(p-Ras)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、p-磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、p-蛋白激酶B(Akt)一抗及二抗(均购自英国Biorbyt)；细胞培养箱(购自常州金坛良友仪器有限公司)；小型800D离心机(购自常州天瑞仪器有限公司)；SH1000型酶标仪(购自中国天美科学仪器有限公司)；CytoFLEX型流式细胞仪(购自美国贝克曼公司)；EPS-300型电泳仪(购自上海天能科技有限公司)；BOT-860型凝胶成像仪(购自北京中仪博腾科技有限公司)。

1.2细胞培养 将NSCLC细胞放置于室温条件的恒温水浴锅中复苏，然后转移至培养瓶，其中含有FBS、适量链霉素和青霉素的完全细胞培养液，于5%浓度CO2、室温、湿度饱和的培养箱中培养，传至细胞生长对数期收集细胞为研究对象。

1.3检测SeC对NSCLC细胞增殖影响 使用胰酶对对数期细胞进行消化，孵育完成即添加完全培养液进行单细胞悬液的制备，将细胞调整为2×105个/ml接种在96孔板，滴加SeC浓度分别为0、5、10、15、20、25 μmol/L各200 μl，各梯度的浓度设置6复孔，孵育至24、48、72 h，进行MTT添加，继续进行4 h的培养，后使用2 000 r/min的离心机10 min，得到沉淀后向其中添加二甲基亚砜(DMSO)共同震荡使其溶解，酶标仪于490 nm波长处检测各孔光密(OD)值。细胞增殖抑制率(%)=(1-给药组OD /对照组OD)×100%。

1.4检测SeC对NSCLC细胞耐药影响 使用胰酶对于对数期NSCLC细胞进行消化，孵育完成即添加完全培养液进行单细胞悬液的制备，将细胞调整为2×105个/ml接种在96孔板，设置GEFITINIB组、预处理+SeC+GEFITINIB组、SeC+GEFITINIB组、预处理+GEFITINIB组，各组6复孔，GEFITINIB组添加0.5 μmol/L GEFITINIB溶液100 μl；预处理+SeC+GEFITINIB组先运用SeC进行预处理，然后添加15 μmol/L SeC 100 ml和0.5 μmol/L GEFFITINIB 100 μl；SeC+GEFITINIB组直接添加15 μmol/L SeC 100 ml和0.5 μmol/L GEFFITINIB 100 μl；预处理+ GEFITINIB组运用SeC进行预处理，孵育0.5 h，添加0.5 μmol/L GEFFITINIB 100 μl。孵育48 h后MTT检测各组的OD值，计算IC50 值，逆转倍数=GEFITINIB组IC50/SeC预处理组IC50。

1.5检测SeC对NSCLC细胞凋亡的影响 按照上述步骤对细胞孵育24 h，分为对照组、GEFITINIB组、SeC组及SeC+GEFITINIB联合用药组，GEFITINIB组中添加200 μl的浓度为0.1 μmol/L GEFITINIB，SeC组添加200 μl的浓度为15 μmol/L的SeC，SeC+GEFITINIB联合用药组先用SeC预处理，然后添加15 μmol/L的SeC 和0.1 μmol/L的GEFITINIB，对照组添加等量的细胞培养液，72 h添加胰酶消化，离心弃上清后磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，进行重悬后添加由荧光素标记的膜联蛋白(Annexin)V ，经固定后离心弃乙醇进行PBS重悬，15 min孵育结束添加碘化丙啶(PI)，流式细胞仪进行各组细胞凋亡率的检测。

1.6Western印迹检测各组NSCLC细胞中相关信号通路蛋白的水平 细胞培养和分组同上，添加裂解液BCA定量试剂盒检测总蛋白，电泳仪进行凝胶电泳，转膜后添加5%的脱脂奶粉进行封闭再添加鼠 p-Ras、p-ERK、p-PI3K、p-Akt一抗(1∶800)，β-Actin为内参，孵育后添加羊抗鼠 Ig G二抗(1∶2 000 )孵育，电化学发光(ECL)试剂盒显、定影，凝胶成像分析仪进行电泳结果的分析，计算蛋白水平。

1.7统计学分析 采用SPSS20.0 软件进行F检验、t检验。

2 结 果

2.1SeC对NSCLC细胞体外增殖的影响 与SeC 0 μmol/L组相比，培养各时间段时SeC 0、5、10、15、20、25 μmol/L组NSCLC细胞OD值均明显下调(P<0.05)，且对肿瘤细胞的增殖抑制率明显上调(P<0.05)，并且SeC的剂量越大，培养的时长越久该差异性越显著。通过计算得知48 h时SeC对于NSCLC细胞IC50、IC15数值分别为20.40 μmol/L、15.60 μmol/L，因此本研究接下来步骤选择15 μmol/L 为SeC浓度。见表1。

表1 SeC对于NSCLC体外增殖的影响

2.2比较各给药培养方式对NSCLC细胞耐药性影响 GEFITINIB组、预处理+SeC+GEFITINIB组、SeC+GEFITINIB组、预处理+GEFITINIB组IC50水平分别为：(0.27±0.04)μmol/L、(0.02±0.01)μmol/L、(0.04±0.01)μmol/L、(0.06±0.01)μmol/L。SeC可显著逆转NSCLC细胞对GEFITINIB药物的耐药程度(P<0.05)，各组细胞耐药逆转倍数为预处理+SeC+GEFITINIB组(13.50)>SeC+GEFITINIB组(6.75)>预处理+GEFITINIB组(4.50)，差异具有显著性(P<0.05)。

2.3各组NSCLC细胞凋亡率比较 SeC组、GEFITINIB组及SeC+GEFITINIB联用组培养的NSCLC细胞的凋亡率均较对照组显著上升(P<0.05)；与SeC组比较，GEFITINIB组及SeC+GEFITINIB联用组培养的NSCLC细胞凋亡率均显著上升(P<0.05)；与GEFITINIB组比较，SeC+GEFITINIB联用组培养的NSCLC细胞凋亡率显著上调(P<0.05)。见图1、表2。

图1 各组细胞凋亡流式图

2.4各组NSCLC细胞中相关信号通路蛋白水平比较 SeC组、GEFITINIB组及SeC+GEFITINIB联用组培养的NSCLC细胞中的p-Ras、p-ERK、p-PI3K、p-Akt蛋白水平均较对照组显著下降(P<0.05)；GEFITINIB组及SeC+GEFITINIB联用组培养的NSCLC细胞中的p-Ras、p-ERK及p-PI3K、p-Akt均较SeC组表达显著下降(P<0.05)；SeC+GEFITINIB联用组培养的NSCLC细胞中的p-Ras、p-ERK、p-PI3K、p-Akt较GEFITINIB组表达显著下降(P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组细胞凋亡率及NSCLC细胞中相关信号通路蛋白水平比较

1～4:对照组，SeC组，GEFITINIB组，SeC+GEFITINIB联合组图2 Western印迹检测各组NSCLC细胞中相关信号通路蛋白

3 讨 论

NSCLC是一类对于人类健康具有严重威胁的疾病，适用手术的患者局限。相较于放、化疗有显著帮助，但其具有不可忽视的毒副作用〔11〕。近年来肿瘤治疗的热点转向了靶向药物治疗，GEFITINIB作为TKI类药物用作治疗NSCLC取得了相当的疗效，同时其于治疗期产生的耐药性也不容忽视，因为这涉及临床治疗结局〔12〕。耐药性的产生有原发和继发两种类型，原发性产生与EGFR信号通路中PTEN功能减弱及K-ras分子的突变等变化相关，继发性产生与肿瘤微环境的变化及促癌性基因的表达增加等相关〔13〕。因此逆转靶向药物在机体中产生的耐药性是提高疗效、确保临床安全的必要举措。相关的研究发现，硒代胱氨酸可以抑制相关蛋白活性，对乳腺癌肿瘤紫杉醇耐药进行抑制，此外，硒代胱氨酸还可以控制多药耐药相关蛋白(MRP)水平来对相关药物治疗胰腺癌耐药效果进行改善〔14～16〕。就其对于NSCLC耐药及体外抗肿瘤的作用鲜见研究。

本研究结果提示，SeC对于 NSCLC细胞的体外增殖具有显著的控制效果，且依赖剂量和时间的特征明显。 通过SeC对NSCLC细胞耐药影响进行检测，结果提示行SeC预处理再进行SeC+GEFITINIB联合用药得到的耐药性逆转效果最佳。本研究结果提示，SeC有显著的促肿瘤细胞凋亡效果，并且其与GEFITINIB联用会进一步对其促进凋亡的效果进行增强，协同治疗作用显著。

TKI靶向药对于EGFR具有抑制作用，EGFR于NSCLC 细胞中具有较高的水平，其机制涉及其控制Ras-Raf-MEK-ERK及PI3K-Akt通路对NSCLC 细胞的血管生成、增殖及转移作用产生影响，TKI靶向药通过抑制信号传导促进细胞周期的阻滞导致凋亡加速，从而发挥抗肿瘤效果〔17,18〕。PI3K-Akt通路的主要转导子涉及PI3K、Akt等，众多与肿瘤转移相关的研究都发现其发挥的重要角色。Ras-Raf-MEK-ERK通路能够对于肿瘤细胞凋亡过程进行调节，通路相关蛋白磷酸化的程度越大，通路的活化程度就越大〔19,20〕。本研究结果提示，SeC+GEFITINIB联用可以降低NSCLC细胞中上述的蛋白表达，下调Ras-Raf-MEK-ERK及PI3K-Akt通路表达或许是SeC逆转耐药的相关机制，具体调控的分子级联效应有待进一步研究讨论。

综上，硒代胱氨酸能够一定程度上逆转NSCLC TKI靶向耐药性，其在体外抗肿瘤的机制涉及抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡及抑制p-Ras、p-ERK、p-PI3K、p-Akt蛋白的胞内水平有关。