同型半胱氨酸通过影响Ang-1和Survivin表达改变血管内皮通透性

蒋欣语 李笑雨 郭锡汉，2 唐唯，2 吴雪，2

(1云南师范大学生命科学学院，云南 昆明 650504；2生物能源持续开发利用教育部工程研究中心)

肿瘤和心脑血管疾病是危害中老年人健康主要的两类疾病。在肿瘤和心脑血管疾病发生发展的过程中，常常伴随着血管新生和血管通透性变化。不成熟的新生微血管通透性增加，是促进肿瘤和心脑血管疾病发展的重要因素。同型半胱氨酸(Hcy)是近年来学术界所关注的一个心血管疾病重要的危险因素。Hcy是蛋氨酸脱甲基作用的代谢产物之一，在健康人体内通常保持低浓度。研究显示，心肌梗死、脑卒中、心力衰竭和闭塞性外周动脉疾病患者的血浆Hcy水平显著增高〔1，2〕。动物实验和体外的动脉粥样硬化、血液凝结实验都证明持续高水平Hcy浓度会促进内皮层的损伤，增强血小板黏附。饮食诱导的高Hcy血症模式动物会出现由血管内皮损伤导致的颈动脉内膜增生〔3〕。血管内皮细胞经过Hcy处理后发现介导单核细胞黏附的细胞因子表达显著上调〔4〕，同时伴随内皮功能紊乱〔5〕。这些现象都与血管内皮层通透性的改变相关，而高浓度Hcy如何影响血管内皮层通透性变化尚未可知。本研究以人脐静脉内皮细胞为模型，检验在Hcy刺激下，血管内皮细胞通透性的变化及维持血管稳定效应的正促血管生成素(Ang)-1和凋亡抑制基因Survivin表达的改变，探讨高浓度Hcy引起血管内皮通透性变化的机制。

1 材料和方法

1.1主要材料和试剂 人脐静脉内皮细胞系HUVEC购于中科院昆明动物研究所细胞库。优等胎牛血清购于美国HyClone公司，RPMI1640培养基、胰蛋白酶购于美国Gibco公司，Hcy购于美国Sigma公司，Transwell购于美国Corning公司，抗体Ang-1、Survivin、GAPDH购于英国Abcam公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG二抗(IgG-HRP)购于美国Santa Cruz公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸 (BCA)蛋白检测试剂盒和电化学发光(ECL)购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2细胞培养 HUVEC培养于含有10%胎牛血清的1640培养基中，置于37℃，饱和湿度和5% CO2的培养箱中(Thermo Fisher)。每隔2 d更换1次培养基，待细胞生长至80%～90%融合时，加入0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例传代。

1.3内皮细胞层的通透性检测 将生长状态良好的HUVEC消化制为细胞密度为6×104个/ml的细胞悬液。0.5 g/L的明胶孵育Transwell(上层容量200 μl，下层容量650 μl)上层1 h，接种细胞于Transwell(直径6.5 mm，孔径尺寸0.4 μm，孔径密度108/cm2)上层(1.5×104个细胞/孔)。待细胞融合形成完整的细胞单层，分组进行药物处理。实验组加入Hcy终浓度分别为5、25、50 μmol/L的培养基，对照组不加Hcy溶液，正常培养基培养，孵育24 h。磷酸盐缓冲液(PBS)清洗Transwell上下层3次，加入牛血清白蛋白溶液(0.2 mg/ml)孵育1 h，收集Transwell下层溶液，加入考马斯亮蓝用酶标仪检测溶液的OD值(波长490 nm)。以牛血清蛋白为标准品，设置7个浓度(0.000、0.022、0.066、0.110、0.154、0.198、0.220 mg/ml)，加入考马斯亮蓝用酶标仪检测出相应的OD值(波长490 nm)，每个浓度设置3个重复。得到OD值与蛋白浓度换算公式y=0.5783x+0.1817(R2=0.990 6)。

1.4Western印迹检测 接种生长状态良好的HUVEC于6孔板中，在37℃，饱和湿度和5%CO2的条件下，使用RPMI1640培养基和10%的胎牛血清培养至细胞融合形成完整的细胞单层。实验组加入Hcy终浓度分别为5、25、50 μmol/L的培养基，对照组不加Hcy溶液正常培养，孵育24 h。弃培养基后PBS清洗3次，6孔板置于冰上，加入裂解液200 μl，吹打后收集裂解液离心，12 000 r/min，4℃，2 min。取少量上清液测样本蛋白浓度，每个样本中取20 μg蛋白上样至蛋白电泳凝胶中，常规电泳后转移到硝酸纤维膜。转膜结束后用5%的脱脂奶粉25℃封闭4 h，Ang-1(1∶500)、Survivin(1∶5 000)和GAPDH(1∶1 000)抗体孵育过夜。二抗37℃孵育1 h，TBST清洗后室温下用显色剂显色。将显色后的膜在暗室用胶片显影、定影。胶片干燥后利用图像分析系统对各电泳条带亮度进行扫描，Ang-1和Survivin的表达量分别用Ang-1阳性着色面积(IOD值)/内参GAPDH 阳性着色面积(IOD值)和Survivin阳性着色面积(IOD值)/内参 GAPDH 阳性着色面积(IOD值)来计算。

1.5统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1不同浓度Hcy处理下人脐静脉内皮细胞层的通透性检测 与对照组相比，Hcy 5 μmol/L组的下层蛋白浓度并无显著性差异(P>0.05)；Hcy 25 μmol/L组下层蛋白溶液浓度显著高于对照组，Hcy 50 μmol/L组下层蛋白溶液浓度显著高于对照组、Hcy 5、25 μmol/L组(均P<0.05)。见表1。

2.2不同Hcy浓度下HUVEC中Ang-1和Survivin的表达 与对照组相比，Hcy 5、25 μmol/L组细胞Ang-1和Survivin表达量均无显著性差异(P>0.05)。而Hcy 50 μmol/L组Ang-1表达量显著低于对照组和Hcy 5、25 μmol/L组，Survivin表达较对照组和Hcy 5 μmol/L组显著下降(P<0.05)。见表1、图1、图2。

表1 各组Transwell下层蛋白浓度及HUVEC中Ang-1、Survivin表达比较

1～4：对照组、Hcy 5 μmol/L组、Hcy 25 μmol/L组、Hcy 50 μmol/L组；图2同图1 不同浓度Hcy处理下HUVEC中Ang-1的表达

图2 不同浓度Hcy处理下HUVEC中Survivin的表达

3 讨 论

血管内皮通透性增强分为两种，一种是内皮细胞表面形成微型孔状结构或微小窝状结构促进小分子通过〔6〕，另一种是内皮细胞之间连接被破坏后形成的缝隙使较大分子渗透〔7〕。研究发现，高水平Hcy浓度将会增强脑部微血管内皮细胞的通透性，使血脑屏障的作用减弱，为发生脑卒中带来更大的概率〔8〕。这一现象在动物实验中得到证实，在高Hcy血症小鼠模型上发现视网膜微血管发生变化和重塑，出现局部缺血，心血管形成和血脑屏障不力等情况〔9〕。本研究结果说明，内皮细胞层的通透性与Ang-1和Survivin的表达负相关，它们可能通过协同作用维持了血管内皮层的完整性。

Ang-1是一种促血管生长的细胞因子，在组织修复及血管发生方面起了一定作用。目前研究发现Ang-1有以下3种功能：通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)，抑制血管内皮的凋亡〔10〕；促进内皮细胞出芽、迁移和成熟，Ang-1通过活化局部的黏附激酶和纤维蛋白溶解酶分泌来诱导内皮细胞的出芽〔11〕；抗感染、维持血管稳定和抗血管渗漏，经Ang-1基因治疗的小鼠可拮抗血管内皮生长因子(VEGF)诱发的血管渗漏，还可阻止炎症引起的中性粒细胞迁移出内皮细胞层〔12〕。Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，高表达的Survivin可以通过线粒体相关途径拮抗内皮细胞凋亡〔13〕，而PI3K/AKT信号通路在线粒体保护及能量代谢中扮演着重要角色〔14〕。提示Hcy增强血管通透性可能通过抑制Ang-1表达下调survivin表达，促进细胞凋亡导致胞间间隙增大，破坏细胞层完整性和稳定性，作用机制与PI3K/AKT信号通路和线粒体途径有关，具体机制需要进一步研究确定。

综上，高水平Hcy增加了内皮细胞层的通透性，并且在Hcy浓度为50 μmol/L的情况下，内皮细胞的Ang-1和Survivin表达显著下调。这一发现将为高Hcy血症所引起的肿瘤和心脑血管疾病提供新的治疗靶点。