2020年猪圆环病毒2型云南流行株的分子鉴定及全基因组序列分析

周玉照，张小苗*，柴 俊

（1.大理农林职业技术学院，云南 大理 671003；2.云南农业大学动物医学院，云南 昆明）

猪圆环病毒（PCV）根据其基因型的不同，目前分为 PCV-1、PCV-2、PCV-3及 PCV-4等 4种血清型[1-2]。而 PCV-1不致病，PCV-2是引起猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的主要病原，PCV-3是一种与猪生殖功能衰竭、皮炎和肾病综合征和多系统炎症相关的新型圆环病毒[3]。PCV-2全基因组有1766～1768个核苷酸，其中ORF2基因编码的 Cap蛋白是 PCV-2主要免疫原性蛋白，能诱导机体产生中和抗体，此外，ORF2还常用于PCV-2的流行病学分析[4]。因PCV-2在世界范围内的广泛流行，使得PCV-2流行毒株的基因亚型相继发生突变，给猪圆环病毒病的防治和疫苗研发带来了困难[5]。因此，对云南 PCV-2流行毒株进行分析很有必要。笔者从云南不同地区采集的疑似PCV-2 43份样品先进行PCV-2病原学检测，再对阳性病料进行全基因测序，利用生物软件对获得的核苷酸序列进行进化分析，同时对获得的ORF2基因序列编码的Cap蛋白与5株疫苗株Cap蛋白作抗原指数差异性比较，从而弄清云南省猪场中PCV-2的基因型及其变异情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 从云南省不同地区发病猪场，采集临床症状疑似猪圆环病的发病猪全血 41份和2份公猪精液，共43份。

1.1.2 主要试剂 rTaq酶、Taq Buffer、ddH2O、大肠杆菌 DH5α感受态细胞、Magen DNA提取试剂盒、pMDl9-T载体、DNA Marker DL-2000，均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA胶回收试剂盒购自昆明锦昂科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参考 GenBank里的PCV-2基因序列（GenBank登录号为 KJ 437192.1），利用生物软件分别设计用于扩增PCV-2-ORF2基因和PCV-2全基因的引物。引物序列 PCV-2-ORF2F 5′-ATGACGTATCCAAGGAG GC-3′，PCV-2-ORF2R 5′-TTAGGGTTTAAGTGG GGGGT-3′；PCV-2-F 5′-ATCCACGGAGGAAGG GGGCCAGTT-3′，PCV-2-R 5′-GTGGATTGTTCT GT AGCATTCTTCCA-3′。引物由宝生物（大连）有限公司合成。

1.2.2 PCR鉴定 用DNA提取试剂盒提取43份病料的总DNA并进行PCR扩增PCV-2-ORF2基因，大小约702 bp，PCR扩增体系：上下游引物各 0.5 µl，10×Taq Buffer 3 µl，dNTP 2.5 µl，rTaq 0.5 µl，DNA 2 µl，ddH2O 21 µl。PCR 扩增程序：预变性 95 ℃ 4 min；变性 95 ℃ 40 s，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 55 s，32个循环；终延伸72 ℃ 5 min。

1.2.3 PCV-2全基因PCR扩增及克隆 将阳性病料的DNA为模板，以引物PCV-2-F/R进行PCR扩增 PCV-2全基因片段，大小约 1 768 bp。将目的片段胶回收纯化后进行阳性克隆，并挑选出阳性克隆的菌落并进行培养。

1.2.4 PCV-2全基因序列测定及分析 将阳性克隆重组质粒菌液送宝生物有限公司进行全基因测序，应用生物软件进行PCV-2蛋白质氨基酸同源性比对、遗传进化分析、PCV-2 Cap蛋白氨基酸比对和Cap蛋白抗原指数预测分析。

2 结果与分析

2.1 PCR鉴定

将PCV-2-ORF2基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，约702 bp处出现与预期大小相符的片段（图1）。

图1 PCV-2-ORF2基因PCR扩增结果

2.2 PCV-2全基因PCR扩增

将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，约 1768 bp处出与预期大小相符的片段（图2）。

图2 PCV-2全基因扩增结果

2.3 PCV-2全基因序列测定及分析

2.3.1 PCV-2蛋白氨基酸比对与遗传进化分析将从公猪精液病料中测序得到的序列命名为 YN PCV2-1，从病猪全血病料中测序得到的序列分别命名为YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-4、YN PCV2-5。用DNAStar中的MegAlign软件与国内外PCV-2进行氨基酸比对和遗传进化分析。结果表明，YN PCV2-1氨基酸同源性在82.0 %～99.1 % 之间；YN PCV2-2氨基酸同源性在81.5 %～99.1 % 之间；YN PCV2-3氨基酸同源性在 66.8 %～84.5 % 之间；YN PCV2-4氨基酸同源性在 83.3 %～98.7 % 之间；YN PCV2-5氨基酸同源性在 79.0 %～93.6 % 之间；YN PCV2-4氨基酸遗传进化分型上与PT-27168-08.HQ831537毒株属于同一个分支，亲缘关系近。YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-5 与其他毒株不属于同一个分支（图3）。

图3 PCV-2蛋白氨基酸遗传进化分析结果

2.3.2 PCV-2 Cap蛋白氨基酸比对分析 用MegAlign软件分别将 YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-4、YN PCV2-5 的ORF2基因与国内外分离株、疫苗株（AY686764 ZJ、GU049340 1010、HM038027 SH、HM 038034 LG、KX161697 YZ）进行氨基酸比对分析。结果发现YN PCV2-5 Cap蛋白氨基酸变化最明显，有8个氨基酸位点出现变异；获得的5株Cap蛋白氨基酸都出现的位点为 25位 F→V，4株Cap蛋白氨基酸都出现的位点为11位K→F、217位A→V、223位M→T，3株Cap蛋白氨基酸都出现的位点为187位G→E/V，25氨基酸位点突变频率最高，其次是 11位、217位、223位，详细结果见表1。

表1 PCV-2 Cap蛋白氨基酸变异位点比对分析结果

2.3.3 PCV-2 Cap 蛋白抗原指数预测分析 应用Protean软件中的 Antigenicity-Jameson-Wolf分析YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-4、YN PCV2-5的Cap蛋白抗原指数并与5株疫苗株（AY686764 ZJ、GU049340 1010、HM038027 SH、HM038034 LG、KX161697 YZ）的 Cap蛋白抗原指数进行差异性分析。结果 YN PCV2-4 Cap蛋白抗原指数与 5株疫苗株的 Cap蛋白抗原指数差异性不大，而 YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-5的 Cap蛋白抗原指数与5株疫苗株的Cap蛋白抗原指数差异性较大，其中在 5～10，25，40～50，70，172～176，210～223区域的抗原指数均不同于疫苗株（图4）。

图4 PCV-2 Cap蛋白抗原指数预测分析结果

3 讨论

目前，猪圆环病毒 2型是严重危害养猪业的疾病之一，给养猪业造成了严重的经济损失[6]。疫苗免疫接种是预防 PCV的主要手段，但目前猪场普遍存在免疫失败的情况，而引起免疫失败的原因有很多，主要包括免疫程序、疫苗品质、存在免疫抑制性疾病、猪场管理等方面的原因[7]。在不同规模的猪场、采取的生物安全措施也各有差异，所以PCV-2感染率也不一样[8]。

在云南省福贡县和花益[9]等报道农村散养户PCV-2感染率为 59 %；2016年宋春莲[10]等在云南地区部分种猪场检测出 PCV-2的阳性为28.71 %；2018年李金凤[11]等在云南省思茅地区猪场蚊 PCV-2检测，其阳性率为 15.96 %，2021年李枝兰[12]等在云南不同地区成功分离到 2株PCV-2分离毒株。可见PCV-2感染已经成为影响云南养猪业的主要疾病之一。而与云南相领的省份也相继报道有PCV-2的感染，2018年李海全[13]等在四川省部分地区检测出 PCV-2的阳性为49.2 %；2018年吴好叶[14]等在贵州省获得了 16株 PCV-2的流行株；2018年吕其壮[15]等在广西北部湾地区检测出 PCV-2的阳性为 42.16 %，李金凤[16]从猪场蚊子体中检测到 PCV2，而且存在PCV2a、PCV2b和 PCV2d 3种亚型，其中PCV2d为主要的基因型。试验从云南各地区采集疑似病料 43份，并从中检测出 5株云南流行PCV-2毒株，其阳性率为 11.63 %，说明云南省PCV-2普遍存在；获得的Cap蛋白氨基酸多处出现突变，Cap蛋白抗原指数与 5株疫苗株存在较大的差异性，多个区域都与疫苗株不相同，说明云南省流行的PCV-2毒株与商品疫苗毒株存在差异，如果养殖场用商品化疫苗进行免疫接种预防猪圆环病毒 2型，可能预防效果会大大降底甚至起不到任何作用，这给云南省PCV-2的防控带来很大难度。

4 结论

云南省普遍存在PCV-2的流行，且流行毒株与目前常用的商品化疫苗毒株相比基因发生了突变。对于云南养猪业来说要引起高度注视，而目前做好养殖厂生物安全是防控该病的最有效手段。